Variables étudiées

2.4.1. Niveau d’anxiété, test de l’open field

L’open field est un dispositif destiné à évaluer le niveau d’anxiété du rat (Prut & Belzung, 2003). La procédure consiste à soumettre un animal à un environnement inconnu duquel il ne peut pas s’échapper. Il s’agit d’une arène circulaire de 125 cm de diamètre en matière plastique sombre entourée par des parois de 60 cm de hauteur (Figure 34) installée dans une pièce différente de la pièce d’hébergement des animaux mais dont le cycle lumineux est synchronisé avec celle-ci. Le rat est déposé au centre de l’arène puis son comportement est filmé durant 4 min. Lors du visionnage des vidéos, le fond de l’arène de l’open field est virtuellement divisé en différentes cases : un rond central, 4 cases internes autour du centre et 4 cases externes. L’activité du rat est évaluée manuellement à l’aide d’un logiciel d’analyse permettant l’entrée en temps réel de chaque comportement grâce au clavier de l’ordinateur (The Observer XT 9.0). Les paramètres évalués sont les suivants : le nombre de cases traversées, le temps passé dans la zone interne (rond central et cases internes) et la zone externe (cases externes), le nombre de fois où le rat s’est levé sur ses 2 pattes arrière et le temps passé à se toiletter. On considère que le rat est entré dans une case lorsqu’il a mis au moins 3 pattes dans celle-ci.

Figure 34. Représentation schématique du dispositif d’open-field vu de profil.

2.4.2. Variables plasmatiques

Les animaux sont euthanasiés par décapitation et le sang du tronc est collecté sur EDTA puis centrifugé à 4 °C. Le plasma est isolé et conservé au congélateur à - 20 °C pour la détermination ultérieure des variables plasmatiques.

Les concentrations plasmatiques de corticostérone et d’ACTH ainsi que les concentrations plasmatiques de leptine et d’insuline sont déterminées grâce à l’utilisation de kits spécifiques (respectivement « Rat stress hormone panel » et « Rat endocrine panel » de Linco Research, St. Charles, MI, USA) sur le système Bioplex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). La concentration plasmatique de glucose est déterminée par une méthode de dosage enzymatique utilisant un kit commercial (Glucose RTU™, Bio-Mérieux, Marcy l'Etoile, France).

2.4.3. Paramètres hypothalamiques

Après décapitation et ouverture de la boite crânienne, le cerveau est basculé et l’hypothalamus est prélevé à l’aide d’outils stériles puis placé dans un tube contenant 1 ml TrizolTM _{(Invitrogen, Carlsbad, CA) refroidi rapidement dans de l’azote liquide avant d’être} stocké au congélateur à - 80 °C pour la détermination ultérieure des ARNm codant le CRF, le NPY et la POMC.

Après homogénéisation des hypothalamus au broyeur à billes (Tissue lyser, Qiagen, Courtaboeuf, France), les ARN totaux sont extraits et leur quantité est mesurée au spectrophotomètre Nanodrop (Labtek, Paris, France) par mesure de l’absorbance à 260 nm. La synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) est réalisée à partir de 400 ng d’ARN totaux en utilisant un kit spécifique (« High capacity reverse transcription kit », Applied Biosystems, Foster City, CA). Les amorces oligonucléotidiques ont été recherchées grâce au logiciel

60 cm

125 cm

Découpage virtuel du sol de l’open field

chaque couple d’oligonucléotides. Les séquences des amorces utilisées sont données dans le tableau 6.

Tableau 6. Séquences des amorces oligonucléotidiques utilisées pour les amplifications en PCR quantitative.

Gènes cibles Séquence

Sens 5'-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3' 18S Antisens 5'-GGGTCGGGAGTGGGTAATTT-3' Sens 5'-CCGCAGCCGTTGAATTTCTT-3' CRF Antisens 5'-TTCTTCACCCATGCGGATCA-3' Sens 5'-AGGCCTTTCCCCTAGAGTTCAA-3' POMC Antisens 5'-GTCGGCCTTCTCGGTATCC-3' Sens 5'-TTTTCCTAGTTTCCCCCCACAT-3' NPY Antisens 5'-CCTGGTGGTGGCATGCAT-3' Sens 5'-CACGGCTAATACAGTGGATCGA-3' MOR Antisens 5'-GGGCAATGGAGCAGTTTCTG-3'

Les réactions de PCR en temps réel sont réalisées avec un système 7300 de chez Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Chaque échantillon d’ADNc est amplifiée dans un volume réactionnel de 20 µl contenant 15 µl de mélange SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA) et 500 nM de chaque amorce spécifique d’un gène. Après une étape de dénaturation à 95 °C de 10 min, 40 cycles de PCR sont réalisés 15 s à 95 °C et 1 min à 60 °C. Le cycle seuil (Ct) d’apparition du produit est déterminé en début de phase exponentielle de la PCR. A la fin des cycles de PCR, une courbe de dissociation est réalisée pour analyser les produits et s’affranchir d’éventuelle contamination par de l’ADN génomique ou par la formation de dimères d’amorces. Deux témoins sont également testés lors de la rétrotranscription : un témoin généré sans l’enzyme et un témoin généré sans ARN.

Une efficacité (E = 10 - 1/pente - 1) de PCR est calculée pour chaque couple d’amorces à partir de la pente déterminée à l’aide d’une courbe étalon réalisée avec un « pool » d’ADNc. Tous les ADNc sont amplifiés avec une efficacité supérieure à 98 %, l’expression du gène est calculée selon la formule 2 - ΔCt avec ΔCt = (Ct gène d’intérêt - Ct du gène 18S).

2.4.4. Profils de prise alimentaire

Les profils de prise alimentaire sont déterminés grâce à l’enregistrement en continu du poids des mangeoires. Les mangeoires sont placées sur des capteurs de pression dont la précision est de 0,01 g (Phimesure, Carpentras, France). Le programme d’acquisition informatique permet d’obtenir une mesure toutes les secondes. La prise alimentaire est mesurée pendant la période de présentation de la mangeoire et pour chaque animal, la structure des repas est analysée avec les

critères suivants. Un épisode alimentaire est une prise alimentaire de plus de 0,1 g et d’une durée supérieure à 10 s (Feurte et al., 2002; Bensaid et al., 2003). Deux épisodes alimentaires sont considérés comme 2 repas distincts s’ils sont séparés de plus de 10 min, sinon ils constituent 2 épisodes alimentaires d’un même repas. L’analyse de la séquence alimentaire permet d’extraire les différents paramètres reliés au repas : le nombre de repas, la taille du repas (kJ), la durée du repas (min), la vitesse d’ingestion (kJ/min) et l’intervalle entre 2 repas (min). Ces paramètres sont analysés sur 24 h mais également lors du cycle nuit et durant 1 h et 3 h après l’exposition au stress.

2.4.5. Séquence comportementale de satiété

La technique consiste à filmer les comportements des animaux durant la 1ère heure de prise alimentaire couplé ou non à un stimulus puis à classer ces comportements en différentes catégories pour déterminer la part relative de chaque comportement dans une tranche de temps donnée permettant la construction de courbes d’évolution des différents comportements (Halford et al., 1998; Rodgers et al., 2010).

La séquence comportementale de satiété (BSS pour « behavioral satiety sequence ») est évaluée pendant la 1ère heure de prise alimentaire immédiatement après l’exposition au stress. Les animaux sont alors dans la cage d’enregistrement du profil de prise alimentaire. Une caméra capable de filmer dans le noir est fixée sur un trépied placé en face de la cage en Plexiglas. La caméra est placée de manière à pouvoir identifier le comportement quelque soit l’endroit où l’animal se trouve dans la cage. Le comportement de l’animal est filmé pendant 1 h puis la vidéo est analysée.

L’activité du rat est évaluée manuellement à l’aide d’un logiciel d’analyse permettant l’entrée en temps réel de chaque comportement grâce au clavier de l’ordinateur (The Observer XT 9.0). Les paramètres mesurés lors de l’analyse des vidéos sont la fréquence et la durée totale des comportements suivants : épisode alimentaire, toilettage, repos, locomotion, levée sur les pattes arrière, reniflement (Tableau 7) (Bensaid et al., 2003). La somme des comportements de locomotion, de levée sur les pattes arrière et de reniflement constitue l’activité. Les données recueillies sur 1 h sont regroupées en 12 intervalles de 5 min permettant la construction des BSS. Pour chaque intervalle de 5 min, les temps consacrés aux épisodes alimentaires, au toilettage, au repos et à l’activité sont calculés et représentés sur un graphique permettant l’évaluation des relations temporelles entre ces 4 comportements (Bensaid et al., 2003; Faipoux et al., 2006). Ce graphique constitue la BSS. Une ligne verticale est tracée sur la BSS et

correspond à la transition à partir de laquelle le temps consacré au repos devient prépondérant par rapport aux épisodes alimentaires (Halford et al., 1998).

Tableau 7. Description des comportements recensés lors de l’analyse vidéo de la 1ère heure de prise alimentaire suivant le stress de nage forcée ou de contention.

Comportement Description

Episode alimentaire Grignoter, mâcher ou avaler de la nourriture dans la mangeoire ou prise dans les pattes avant

Toilettage Gratter, lécher ou mordre la fourrure, les moustaches, les pattes, les _{organes génitaux ou la queue} Levée sur les pattes arrière Les pattes avant ne touchent plus le sol, position debout sur les

pattes arrière, appuyé contre la paroi de la cage ou non

Reniflement Mouvement de la tête avec le reste du corps immobile, frémissement _{des vibrisses dirigé vers un aspect de l’environnement} Locomotion Marcher dans la cage ou se retourner sur place, impliquant un

mouvement des 4 pattes

Repos Position de relaxation assis ou allongé, animal inactif

2.4.6. Poids et composition corporelle

Dans toutes les études, le poids est mesuré chaque jour. Suite au SCV, la composition corporelle des rats est déterminée. Les tissus adipeux sous cutanés, rétropéritonéales et épididymaires sont prélevés et pesés. La carcasse est également pesée afin d’obtenir un indice de la masse maigre de l’animal. Enfin, les glandes surrénales et le thymus sont prélevés puis pesés.