Trois autres variétés ont été choisies mais cette fois-ci des variétés population. La première est la Bladette de Provence, la deuxième Saint Priest Le Vernois Rouge et enfin Redon Roux Pâle. Ces trois variétés ont été choisies car elles avaient des origines géographiques différentes et pourraient donc représenter une diversité intéressante.
C. Légumineuse
Semée en même temps que le blé, la légumineuse choisie par les agriculteurs est la féverole d'hiver Diva (Vicia faba). Elle a été choisie car elle est particulièrement adaptée à l'agriculture biologique, elle est assez résistante au gel et peu sensible à la verse. Elle permettrait donc de former un tuteur pour les blés. De plus, d'après la fiche technique de l'ITAB, la féverole est très bien adaptée en région Bretagne (Annexe 5 : fiche technique ITAB, 2012).
II. Itinéraires techniques du blé
2.1 Description des parcelles
A. Lycée Théodore Monod (Figure 11 : Photo aérienne parcelle)
La première parcelle étudiée est la parcelle du lycée Théodore Monod au Rheu. Le semis s'est effectué le 4 novembre 2014. Les conditions météorologiques étaient plutôt bonnes. En effet, le temps était ensoleillé avec quelques nuages et la veille il avait plu 4,5mm. Les semences ont été traitées au Tillecur, un fortifiant qui permet aussi de limiter les risques de Carie du blé. Ce traitement a été dosé à 1 kg pour 100kg de semences. Avant le semis, un labour perpendiculaire au semis a été réalisé. Puis le passage d'une herse rotative le même jour a été effectué. Le semoir appartient à l'INRA et sa largeur est de trois mètres. La largeur totale d'une bande semée est de 2,70 mètres et les inter-rangs de 15cm. Les densités de semis et le poids moyen des grains est différents selon les variétés et association. (Tableaux
5 et 6 : Densités et Poids moyens des grains)
:
Figure 13 : Photos représentant les bandes de blés et l'association avec la féverole sur les deux lieux, Gilles et au lycée.
Figure 14 : Cycle de développement du blé, terre-net.fr
14
B. Gilles Simmoneaux (Figure 12 : Photo aérienne parcelle)
La deuxième parcelle correspond à celle d'un agriculteur nommé Gilles Simmoneaux situé à Chavagne. Les variétés semées sont les mêmes que la parcelle du lycée et sont placées de la même manière. Le semis a été effectué le 6 novembre précédé d'un labour perpendiculaire au semis, avec une herse rotative avec le semoir de l'INRA. Les longueurs entre les rangs et des bandes sont identiques à celles du lycée. Enfin, les semences ont été traitées à la Silice avec un mouillant à une hauteur de 100g pour 100kg de semences. Enfin, un maïs a été implanté l'année précédente juste après le retournement d'une prairie de plus de 5 ans. En ce qui concerne les densités de semis et les largeurs de bandes, celles-ci sont identiques à celles du lycée.
Voir Figure 13 bandes terrain du lycée et chez Gilles
III. La collecte d'échantillons
Pour étudier les mycorhizes, il faut observer les racines de blé. Concernant le prélèvement des plants, celui-ci a été réalisé au stade montaison le 20 et le 21 avril 2015. Le stade de référence est en général le stade où la plante a des besoins maximum en phosphore. Pour chaque culture, selon sa dépendance, il existe un niveau "normal" de mycorhization à ce stade. Par exemple, pour le blé, un niveau normal de mycorhization à la montaison est de l'ordre de 40% (Gaël ALVAREZ et al., 2002) (Figures 14: Cycle de développement du blé, terre-net.fr).
Pour une modalité (trois bandes), douze plantes ont été prélevées (4 plants par bande). Dix morceaux de racines ont été observés par plant après avoir été montés sur une lame; et enfin, deux observations par racine ont été réalisées au microscope. Le prélèvement au champ a été réalisé au hasard mais respecte un espace homogène de plants et n'est pas réalisé sur les bordures. Cet espace homogène représente une petite surface sur la bande où les blés sont environ de même taille afin de représenter au mieux les blés de cette bande. On évite donc les pentes, les zones de mauvaises levées et les endroits hétérogènes.
L'échantillon est prélevé à l'aide d'un couteau ou d'une bêche. Le système racinaire est ainsi prélevé à environ 10 cm de profondeur en abîmant le moins possible les petites racines qui
15 nous intéressent pour l'observation. Le bloc de terre ainsi récolté et séparé des épis du blé, est placé dans un sac portant la référence de l'échantillon.
Les dix systèmes racinaires sont ensuite rincés à l'eau du robinet. Débarrassés de leur terres, les plants sont séchés à l'air libre (Figure 15 : Photo séchage) puis remis dans leur sac afin d'y prélever au fur et à mesure les plus fines racines. En effet, d’après des observations in vitro chez Medicago. Truncatula, les jeunes racines latérales sont les sites préférentiels d’interaction avec le champignon à arbuscules (Chabaud et al., 2002).
IV. Protocole de coloration et d'observation des racines
4.1 La coloration
Afin d'observer les mycorhizes au microscope, il faut en premier lieu décolorer les racines puis colorer les champignons qui les colonisent. Cette méthode établie par Phillips and Hayman en 1970 puis modifiée par Vierheilig et al. en 1998 se réalise ainsi :
Une décoloration à 90°C dans une solution de KOH à 10% pendant 20 minutes est tout d'abord réalisée. Cette étape a pour but de vider le contenu des cellules racinaires par osmose. En effet, le déplacement d'eau de la solution la moins concentrée vers la plus concentrée, induit la dilution et donc la décoloration des racines. Les racines sont ensuite rincées à l'eau acidifiée à l'HCl avant d'être colorées dans une solution contenant du bleu de trypan à 0.05% placée au bain marie pendant 3 minutes. Ce système de coloration est très utilisé pour les endomycorhizes mais nécessite des modifications en fonction de la plante étudiée, notamment par rapport à la taille et du type de ses racines.
4.2 Protocole adapté aux racines de blé
Les étudiants en stage dans l'équipe BCRP ont mis au point un protocole spécifique adapté aux racines de blé :
· La décoloration : Les racines les plus fines, préalablement coupées d'environ 1 cm, sont placées dans des tubes à essai contenant une solution de 10 mL KOH à 10%. Les tubes sont ensuite plongés dans un bain marie à 90°C pendant 30 minutes.
Tableau 7 : Matériels et solutions utilisés pour les manipulations
Figure 16 : Photo de la préparation des lames à observées au microscope
Figure 17 : Schéma de la disposition des racines et technique d'observation des racines sur lame et lamelle Matériels Solutions - Fiole jaugée 100 mL - Bain marie 90°C - Pipette graduée 10, 20 mL - Eprouvette graduée 10mL - Béchers de 20, 50 mL - Microscope optique - Verres - Matériels de dissection - Tubes à essais - Lames et lamelles - Eau distillée - Solution KOH à 10% - Vinaigre d'alcool 8% - Encre noire du commerce
16 · Le rinçage : Il se réalise avec trois bains à la suite d'eau du robinet dans des verres
puis dans un verre d'eau distillée.
· Préparation de la dilution pour la coloration : 5 mL d'encre noire du commerce (super U) sont prélevés à l'aide d'une pipette graduée puis placée dans une fiole jaugée de 100 mL. La fiole est ensuite remplie jusqu'au trait de jauge avec du vinaigre d'alcool du commerce à 8%.
· La coloration : Les racines récupérées sont placées dans des tubes à essai contenant environ 10 mL de la solution d'encre et de vinaigre obtenue auparavant. Les tubes à essai sont ensuite replongés au bain marie pendant 1 minute à 90°C. Les racines récupérées sont transvasées dans une solution du même vinaigre d'alcool utilisée auparavant dans une boîte de pétri afin de décolorer les racines et d'accentuer le contraste entre les cellules et les mycorhizes.
Le matériel et les solutions utilisées sont décrits dans le Tableau 7.
V. Observation et quantification de la colonisation racinaire par les
mycorhizes
Annexe 8 : fiche laboratoire annotation
Au microscope, on réalise deux observations par morceau de racine (Figure 16 et 17 : schéma des lames; photo lames). La quantification de la colonisation des racines par le champignon est réalisée d'après la méthode d'intersection agrandie décrit par McGonigle et al., 1990. Après avoir réalisé le protocole de coloration, les racines sont placées perpendiculairement à l'axe de la lame sans qu'il y ait de chevauchement entre les racines. La notation est basée sur l'observation au microscope optique au grossissement X10 de l'intersection perpendiculaire entre l'axe de la racine et l'axe du pointeur installé sur l'objectif.
Chaque observation consiste à évaluer :
- Le taux global de colonisation des mycorhizes sur la racine observée (échelle de 0 à 5, voir Annexe 6 Gamme étalon)
- La présence ou non d'hyphes (0=absence, 1=présence)
- La présence ou non de vésicules (0=absence, 1=présence)
17 Afin d'évaluer la colonisation globale des racines par les mycorhizes, une gamme étalon a été créée par les précédents étudiants dans le but que les résultats soient le plus cohérents possibles. Cette gamme présente sur une échelle de 0 à 5 la colonisation par les mycorhizes et permet d'attribuer une note pour chaque observation en fonction de l'importance de la présence des mycorhizes. La méthode est donc identique pour chaque fragment de racine.
Ø Analyses des résultats
Pour lire facilement les résultats, on calcule les différents taux de colonisation mycorhizien en pourcentage, (colonisation globale, présence de chaque organe) en rapportant la totalité des observations par modalité sur une échelle de 100 grâce à des tableaux croisé-dynamiques sous Excel. Cette valeur correspond donc au pourcentage de colonisation globale des mycorhizes au niveau de la modalité cultivée, ou au pourcentage de présence de chaque organe pour une modalité analysée. Les résultats sont présentés sous forme de moyennes et écarts-types associés.
0 10 20 30 40 50 60 blé blé + leg blé blé + leg Modernes Population
Pourcentage moyen de la colonisation
Type de variétés en association ou non
Graphique 1 : Colonisation globale entre le blé en mélange associé ou non avec une féverole au Lycée
0 10 20 30 40 50 60 Blé Blé + leg Blé Blé + leg Modernes Population
Pourcentage moyen de la colonisation
Type de variétés en association ou non
Graphique 2 : Colonisation globale entre le blé associé ou non avec une féverole chez Gilles
Graphique 1 : Représentation de la colonisation globale des mycorhizes sur le blé en mélange associé ou non à une féverole au lycée.
Graphique 2 : Représentation de la colonisation globale des mycorhizes sur le blé en mélange associé ou non à une féverole chez Gilles.
18
Résultats et discussions
I. Résultats
1.1. Influence de l'association avec une féverole
Le premier facteur observé pour cette expérimentation est l'influence de l'association avec la féverole sur la mycorhization d'une parcelle. Selon les études bibliographiques, l'hypothèse est que la présence d'une légumineuse associée au blé favorise la mycorhization de celui-ci.
On s'aperçoit, tout d'abord, d'après le graphique 1 que la colonisation moyenne des champignons par les racines au lycée est plus élevée en mélange avec une féverole pour les variétés modernes contrairement à la colonisation en mélange sans féverole. Ce résultat confirmerait l'hypothèse. En revanche, pour les variétés populations, les tendances sont inverses et contraires à nos hypothèses. En effet, le pourcentage de colonisation moyenne des racines varie de 42% pour le mélange sans féverole à 25% pour l'association avec une féverole. Nous nous sommes en premier lieu demandé si ces résultats pouvaient être causés par certains facteurs tels qu'une mauvaise manipulation sur le terrain (échange de sac, erreur de suivi...) ou une mauvaise manipulation au laboratoire (changement de protocole, erreur sur l'observation au microscope...). Or, ces hypothèses ont été exclues car ayant remarqué que les premiers résultats ne coïncidaient pas avec nos hypothèses de départ, j'ai réalisé la même manipulation trois fois de suite au laboratoire. Les résultats ainsi obtenus étaient les mêmes pour les trois expériences. Nous nous sommes donc penchés vers les résultats de la parcelle de Gilles.
Nous y avons observé pour les mêmes facteurs (variétés populations et modernes en mélange ou en association), (graphique 2) qu'il y a une forte augmentation de la colonisation des racines par les mycorhizes pour les variétés du mélange modernes avec féverole par rapport au mélange sans féverole. Cependant, cette augmentation n'est pas observée pour les blés populations. En effet, chez Gilles, les blés populations qu'ils soient cultivés en
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
Mélange Chevalier Pireneo Renan Mélange Bladette Redon St Priest
Modernes Population
Pourcentage moyen de colonisation
Type de variétés et variétés des blés
Graphique 3 : Comparaison de la colonisation des racines par les mycorhizes des blés purs ou en mélange chez Gilles et au lycée
Gilles Lycée
Graphique 3 : Pourcentage de colonisation des racines par les mycorhizes en fonction des blés purs ou en mélange et du type de variétés chez Gilles et au lycée.
19 association avec une féverole ou non, ont tous un taux de colonisation des racines à hauteur de 42%. L'effet de la légumineuse sur la mycorhization n'est donc pas vérifié pour les variétés populations voire même contredit. Il pourrait donc y avoir ici un effet de la légumineuse sur la mycorhization plus important pour les variétés modernes que les populations.
Il faut tout de même noter que la colonisation globale des blés en mélange pur aurait tendance à être plus importante pour les blés populations que modernes. Il pourrait donc y avoir un seuil de saturation de la mycorhization pour les blés. Les blés populations en mélange pur ayant déjà une tendance à plus mycorhizer, auraient pu atteindre ce seuil de mycorhization ce qui empêcherait la féverole d'augmenter le taux de colonisation. Par ailleurs, la féverole augmenterait la mycorhization des blés modernes chez Gilles et au lycée car le seuil de saturation ne serait pas atteint par les mycorhizes des blés modernes en mélange pur. Ce seuil de saturation engendrerait donc une compétition entre les blés populations et de la légumineuse lorsqu'ils sont associés ce qui expliquerait l'effet nul voire négatif de la légumineuse sur la mycorhization des blés populations chez Gilles et au lycée. La légumineuse pourrait donc stimuler la mycorhization lorsqu’elle est faible mais aurait tendance à l’inhiber lorsqu’elle est déjà élevée.
1.2. Influence du mélange de variétés et du type de variétés
A. Mélange/variétés simples
En ce qui concerne ce facteur, nous étudions ici plusieurs variétés (trois populations et trois variétés commerciales) cultivées seules et en mélange. Une première hypothèse pour ce facteur est que les variétés, qu'elles soient modernes ou populations, mycorhizent plus en situation de mélange qu'en culture simple.
Sur le graphique 3, on aperçoit une légère augmentation de la mycorhization pour les cultures en mélanges que ce soit populations ou modernes au lycée par rapport aux variétés simples. En revanche, pour les variétés modernes chez Gilles ces résultats sont inverses. Il est donc difficile d'exploiter ces résultats.
38,0 31,3 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0
Variétés population Variétés modernes
Pourcentage moyen de colonisation
Type de variétés
Graphique 4 : Total de la colonisation globale entre les variétés modernes et populations
Graphique 4 : Pourcentage total de la colonisation des racines par les mycorhizes en fonction des variétés modernes et populations.
20 Par ailleurs, on observe que dans les variétés populations chez Gilles et au lycée, la Bladette a un taux de colonisation élevé (de 39,4% pour Gilles) contrairement aux autres variétés populations en culture simple (de 32,3% pour Saint Priest et de 30,3% pour Redon). On se demande donc si la Bladette pourrait avoir une influence sur la colonisation du mélange des blés populations ou s'il existe une synergie entre les trois variétés cultivées ensemble.
Au lycée, les trois variétés populations en culture simple (Saint Priest, Bladette et Redon simples) atteignent une valeur moyenne de colonisation des racines de 34,1% tandis que la colonisation globale du mélange des variétés populations atteint une valeur de 41,5%. Ces valeurs se retrouvent chez Gilles. Elles montreraient donc une synergie entre les variétés lorsqu'elles sont cultivées en mélange. Il pourrait donc y avoir un effet intra variétal sur la mycorhization des blés populations et non une simple influence de la Bladette sur la colonisation.
Ces valeurs restent tout de même approximatives sachant que les écarts types sont élevés.
B. Variétés populations versus variétés modernes
On observe sur le graphique 3 la colonisation globale entre les variétés en culture simple ou en mélange, des blés populations ou modernes que les variétés populations mycorhizent plus que les modernes. En effet, la moyenne de la colonisation des racines par les mycorhizes pour les variétés populations chez Gilles et au lycée atteint une valeur de 38% contrairement aux variétés modernes qui atteint une valeur de 31,3% (voir graphique 4). Ces observations montrent bien que pour n'importe quel lieu (lycée ou Gilles) les variétés populations ont tendance à plus mycorhizer que les variétés modernes. Cela conforte nos hypothèses de départ. Une explication à ces résultats serait l'histoire de la sélection de ces différents types de blés. En effet, comme indiqué auparavant, les blés modernes sont le fruit d'une sélection réalisée dans des conditions d'intrants chimiques. Cela pourrait leur conférer une "dépendance" aux intrants et donc entraîner une perte de leur capacité à s'adapter aux milieux et donc, par exemple, à mycorhizer (les intrants apportant des éléments nutritifs dont le blé a besoin, les racines perdent leur capacité à interagir avec le sol car les critères de sélection sont développés sur d'autres aspects comme la capacité à valoriser les intrants). En revanche, les blés populations provenant de sélection aux champs en agriculture biologique,
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Modernes Populations
Pourcentage moyen de la colonisation
Type de variétés
Graphique 5 : Total de la colonisation globale entre les variétés modernes ou populations chez Gilles et au lycée
Gilles Lycée 0 10 20 30 40 50 60 70 Blé Blé + leg Blé Blé + leg Modernes Population
Pourcentage moyen de la colonisation
Type de variétés en association ou non
Graphique 6 : Colonisation globale en fonction des répétitions au lycée
Rep 1 Rep 2 Rep 3
Graphique 5 : Pourcentage total de la colonisation des racines par les mycorhizes en fonction des variétés modernes et populations et en fonction du lieu.
Graphique 6 : Représentation de la colonisation globale des mycorhizes en mélange associé ou non à une féverole en fonction des répétitions au lycée.
21 s'adapteraient plus facilement aux milieux et pourraient donc mycorhizer davantage lors du besoin notamment en phosphore du blé. De plus, d'après certaines études, les blés modernes n'auraient pas développé de système racinaire important car tous leurs besoins venant des intrants se situeraient en surface. Cela pourrait engendrer une plus faible surface sur les racines pour les mycorhizes et être une réponse à ce résultat.
1.3. Influence du lieu
Par ailleurs, en observant le graphique 5, on s'aperçoit que chez Gilles la colonisation est plus importante pour les blés populations par rapport au lycée tandis qu'elle l'est moins pour les blés modernes. En effet, les variétés modernes auraient tendance à plus mycorhizer chez Gilles qu'au lycée et inversement pour les variétés population. Cette différence montre qu'il n'y a pas d'effet lieu lorsque l'on observe le type de variétés car les différences ne sont jamais significatives.
De plus, une observation avait été faite sur la faible colonisation des racines pour les blés populations en association avec une féverole au lycée. Mise à part l’effet du seuil de saturation, nous nous sommes demandé si les résultats pouvaient s'expliquer par la nature, la composition ou le travail du sol. La parcelle du lycée était en effet principalement réservée au maraîchage avant l'implantation du maïs et du blé. Ces cultures nécessitent beaucoup d'interventions à plusieurs reprises dans l'année étant donné la durée des cultures courtes,