Para determinação do nível de IgG no sangue do neonato existem testes semiquantitativos que referem um intervalo para o valor e testes que indicam exatamente a sua concentração em mg/dl que são denominados testes quantitativos (Lester 2011).
4.1 Métodos quantitativos
4.1.1 Imunodifusão radial Simples (SRID)
O teste de imunodifusão radial simples é geralmente considerado o gold standard para medição na concentração de IgG no sangue (Wong et al, 2013). Nos anos 80 e 90, a SRID foi muito usada como método de comparação para demonstrar a fiabilidade de testes rápidos comerciais de determinação de IgG no soro, plasma ou sangue total (Ley et al., 1990).
Este método tem por base uma reação antigénio-anticorpo. O soro do poldro a ser testado é colocado em Agar Gel contendo anticorpos anti-IgG equino. Ocorre, assim, difusão do antigénio e anticorpo, com agregação de ambos, seguida de precipitação, sendo medido o diâmetro do anel de precipitação produzido, e procedendo-se depois à comparação com padrões conhecidos. Contudo, a obtenção de resultados é demorada (18 a 24 horas) e trata- se de um método dispendioso, sendo por isso pouco utilizado (Baird et al., 1987; Sellon, 2000; Tizard, 2004; Riley et al., 2007). Sendo a medição do anel de precipitação medido pelo ser humano este teste apresenta alguma suscetibilidade a erros (Wong et al., 2013; Fouchet et al., 2014).
4.1.2 Imunoensaio turbidimétrico
O imunoensaio turbidimétrico consiste na avaliação da dispersão da luz da amostra após a junção com o reagente. Há formação de um precipitado por aglutinação imunológica entre as IgGs da amostra quando são adicionados anticorpos anti-IgG equina (reagente). Os complexos formados estão na origem da mudança de turbidez, que será proporcional à concentração de IgG. Esta mudança de turbidez reduz a quantidade de luz transmitida através
da amostra, que é obtida através de espectrofotometria e traduz a concentração de IgG (Wong et al., 2013). Este teste minimiza potenciais erros humanos e demora cerca de 10 minutos a saber o resultado após recolha e centrifugação do sangue. Pela sua rapidez na obtenção de um resultado concreto este teste é bastante útil em situações clinicas onde temos de tomar decisões em pouco tempo (MCue, 2007; Ujvary et al., 2017). O TIA tem sido sugerido como alternativa ao SRID para gold standard para doseamento da concentração de IgG (Davis et al., 2005; McCue, 2007; Ujvary et al., 2017).
4.2 Métodos semiquantitativos
Vários testes semiquantitativos de rápida execução e de baixo custo têm sido provados ter uma sensibilidade e especificidade aceitáveis. Como exemplo temos o teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), teste da turbidez do sulfato de zinco, teste da coagulação do glutaraldeído e o teste de aglutinação do latex (Ujvary et al., 2017).
4.2.1 ELISA
O ELISA corresponde ao método semiquantitativo mais usado, pois é de uso fácil, a obtenção de resultados é rápida (10 minutos), está disponível comercialmente e é económico. Este tipo de teste dá-nos um intervalo de valores de < 400 mg/dL , entre 400 e 800 mg/dL e > 800 mg/dL (Wong et al., 2013). Um exemplo deste teste no mercado é o SNAP Foal IgG Test® (IDEXX® Laboratories, Westbrook, Me).
Trata-se de um teste rápido imunoenzimático, no qual são adicionados sangue total diluído, soro ou plasma e reagente conjugado ao dispositivo do teste, ficando assim ativado. Após a libertação do reagente, a intensidade de cor azul desenvolvida no poço da amostra é proporcional à concentração de IgG presente (Metzger et al., 2006).
O ELISA é um método bastante preciso para a deteção de FTIP (Bertone et al., 1988). Segundo Metzger et al. (2006), este teste demonstrou uma boa sensibilidade mas uma fraca especificidade, o que sugere que muitos poldros doentes que obtêm adequada TPI, podem ser diagnosticados como tendo FTIP. Foi também sugerido que este método não deve ser efetuado para diagnóstico de FTIP em poldros doentes, especialmente na presença de bacteremia e hiperfibrinogenemia (Metzger et al., 2006). Segundo Ujvary et al. (2017) este teste apresenta uma sensibilidade e especificidade mais baixa na deteção de valores <800
mg/dL (69 % e 79% respetivamente) do que na deteção de valores < 400 mg/dL (94% e 100% respetivamente).
Este teste torna-se então uma forma prática e rápida de numa situação de campo podermos inferir sobre a imunidade do poldro e uma posterior mudança de atitude perante o caso (Ujvary et al., 2017).
4.2.2 Teste de aglutinação do latex
Este teste baseia-se na aglutinação entre as IgGs do soro com anticorpos anti-IgG equina que posteriormente são absorvidas pelas partículas de látex. A quantidade de aglutinação é proporcional à concentração sérica de IgG (Crisman & Scarratt, 2008). A obtenção de resultados através deste teste é rápida, demorando apenas 10 minutos. No entanto o limite máximo de deteção de IgG é de 4 g/L (Bertone et al., 1988). Estudos mais recentes comprovaram sensibilidades baixas para este teste descartando este teste para diagnóstico de FTIP (Crisman & Scarratt, 2008).
4.2.3 Teste de coagulação do glutaraldeído
O princípio deste método baseia-se na coagulação das IgG quando é adicionado ao soro uma solução de glutaraldeído. É adicionado solução de 10 % de glutaraldeído, e o tempo que demora a ocorrer a formação do gel indica o valor de IgG. Se formação do gel ocorrer em 10 minutos indica uma concentração de IgG igual ou superior a 800 mg/dL g/L, e se o gel se formar até 60 minutos indica uma concentração superior a 400 mg/dL. Está descrito também a utilização de uma solução a 20 % e neste caso considera-se que se o tempo de formação do gel for até 60 minutos então a concentração de IgG é igual ou superior a 200 mg/dL e se o gel se forma em 60 minutos ou mais, a concentração de IgG é inferior a 200mg/dL (Beetson et al., 1985; Saikku et al., 1989; Sedlinska et al., 2005).
Este tipo de reação ocorre também entre o glutaraldeído e o fibrinogénio pelo que em poldros doentes com um aumento da concentração de fibrinogénio existe a possibilidade de obter falsos positivos (Brink et al., 2005). Este método tem também como desvantagem o facto da ocorrência de hemólise poder sobrestimar a concentração de IgG (Beetson et al., 1985; Sedlinska et al., 2005).
4.2.4 Teste da turbidez do sulfato de zinco
Este teste tem como base a formação de um precipitado pela junção das imunoglobulinas com os iões de zinco em solução. A coloração adquirida é comparada com um padrão, referindo assim um intervalo de valores em que grau de turbidez é diretamente proporcional à concentração de imunoglobulinas. É importante realçar o facto de que este teste estima o total das Imunoglobulinas. Em caso de dúvida pode utilizar-se um espectrofotómetro para estimar de forma mais precisa através de uma curva padrão. Uma grande desvantagem é a influência do pH da solução de sulfato de zinco no resultado final. Um armazenamento prolongado do reagente ou um contacto com o dióxido de carbono atmosférico prolongado pode levar a alterações do mesmo. No entanto é um teste de baixo custo, prático e com sensibilidade especificidade suficiente para diagnóstico de falha de transferência de imunidade em situação de campo (Sedlinska et al., 2005; Vivrette, 2011).