Validation du modèle 3D

Cette étape est indispensable et elle est basée sur plusieurs paramètres :

1.6.1. Validation de l’architecture des cytochromes P450s

L’architecture du modèle est comparée à celle des autres cytochromes, notamment en vérifiant la présence des 12 hélices α (A à L), 6 feuillets β, et des petites hélices (B’, G’, J’, K’). Nous avons également vérifié la présence des motifs caractéristiques de cette famille de protéines :

1. Motif W(R/K)XXR (X correspondant à n’importe quel acide aminé) au sein de l’hélice C qui

est nécessaire pour la liaison et la stabilité de l’hème dans le site actif ; 2. Motif EXXR au sein de l’hélice K ;

3. Motif (W/F)XXPXX(F/Y)XPX(H/R)(W/F) situé après l’hélice K’ et qui comprend la région « meander » ;

4. Motif XXF(G/S)XGX(H/R)XCXGXX(L/F)AXXE situé avant l’hélice L contenant le résidu

84 5. L’acide glutamique très conservé entre les différentes structures et probablement impliqué dans la formation du canal d’eau qui est important pour la réaction catalytique (Poulos and Raag, 1992) : cet acide glutamique correspond au Glu366 dans le CYP101, Glu459 dans les CYP11B1 et B2 et Glu437 dans le CYP21 ;

6. La thréonine catalytique qui est très conservée et situées au milieu de l’hélice I : cette thréonine correspond à la Thr252 dans le CYP101, Thr318 dans les CYP11B1 et B2, Thr295 dans le CYP21 (Poulos and Raag, 1992).

1.6.2. Attribution des structures secondaires

Le serveur MATRAS http ://biunit.aist-nara.ac.jp/matras/ nous a permis d’aligner nos modèles avec le « template » afin de vérifier la bonne homologie de séquences.

1.6.3. Superposition des structures tertiaires

Il a été montré que le calcul d’écart quadratique moyen ou déviation structurale (en anglais « RMSD » pour Root Mean Square Deviation), entre la structure modélisée et la structure cristallographique de départ, est une bonne méthode d’évaluation et de comparaison entre protéines modélisée et cristallisée.

La superposition du modèle et du « template » a été réalisée grâce au serveur

http ://wishart.biology.ualberta.ca/SuperPose/, ce qui a permis d’obtenir le rapport RMSD. Il est recommandé que ce rapport soit inférieur à 2, avec une tolérance jusqu’à 4.

1.6.4. Elaboration du diagramme de Ramachandran

Nous avons obtenu le diagramme de Ramachandran grâce au serveur RAPPER

http ://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.php qui permet de vérifier la cohérence de la structure élaborée. On peut également se servir de la version fournie par swiss pdb viewer (menu « Window », fonction « ramachandran plot »).

La compréhension de ce diagramme nécessite le rappel de quelques notions de base sur la structure des protéines :

1- Structure primaire :

C’est la séquence linéaire des acides aminés (ou résidus) liés entre eux par une liaison peptidique. Les ponts disulfures sont inclus dans cette structure.

85

2- Structure secondaire :

a- Le squelette

Chaque acide aminé est constitué d’un squelette (N, Cα, C et O) également appelé chaîne principale, et d’une chaîne latérale. Deux angles dièdres phi φ (entre le N et Cα) et psi ψ (entre Cα et le C) sont à l’origine des différentes conformations que peut prendre un polypeptide. La liaison peptidique qui relie deux acides aminés successifs est caractérisée par un angle dièdre ω (entre le C du résidu n et le N du résidu n+1) constant (180° dans la quasi-totalité des cas ce qui correspond à une conformation trans) (figure 23).

FIGURE 23 : Liaison peptidique et les différents angles dièdres

b- Les conformations

Les stéréoisomères sont des molécules de même composition atomique mais d’arrangement spatial différent.

Deux molécules dont la disposition des atomes dans l’espace est indépendante des rotations autour des liaisons simples sont des énantiomères. Il y a deux configurations R et S suivant si la rotation se fait dans le sens des aiguilles d’une montre ou pas.

Deux molécules dont les arrangements des atomes ne se différencient que par des rotations autour des liaisons simples sont des diastéreoisomères. Ce sont des conformations L et D. Cette nomenclature suit la Loi de CORN (acronyme de COOH, R et NH2). Si on forme CORN dans le sens des aiguilles d’une montre c’est L sinon c’est D. Les acides aminés naturels sont de conformation L (sauf la glycine).

c- Diagramme de Ramachandran (figure 24) Trois zones sont définies :

86 -Zone a : hélices droites

-Zone b et p : feuillets -Zone l et g : hélices gauches

FIGURE 24 : Diagramme de Ramachandran

Même dans les boucles seules ces zones sont permises et celles qui sont interdites sont notées x. Dans la plupart des cas les angles dièdres phi sont négatifs sauf la glycine et l’asparagine (zone l et g). La proline occupe souvent la portion p et la zone bêta du diagramme de ramachandran.

A noter que PGDSN sont majoritairement dans les boucles, LM dans les hélices et IV dans les brins. H est indifférent.

1.6.5 Calculs des énergies par la méthode Anolea

La méthode Anoléa (Melo F et L 97 et 98) réalise les calculs d’énergie au sein d’une chaîne protéique, évaluant ainsi l’environnement à distance pour chaque atome. Ce calcul provient d’une base de données de 147 chaînes protéiques avec une identité de séquences inférieure à 25 % et analysées par diffractométrie de rayons X (résolution inférieure à 3Å).

1.6.6 Minimisation d’énergie par le logiciel Gromos

Ce programme, inclus dans « DEEP VIEW », permet d’effectuer une minimisation d’énergie en réparant, par déplacement des atomes, les géométries déformées; ceci conduit à supprimer les contraintes internes, comme le montre la figure 25 :

87 Avant minimisation Après minimisation

FIGURE 25 : Géométrie d’une molécule avant et après minimisation d’énergie

On peut ainsi pour chaque acide aminé calculer le champ de force et valider l’énergie qui lui est liée.

1.6.7. Analyse de la compatibilité structure 3D – structure primaire Verify 3D

Elle est basée sur l’utilisation du serveur Verify 3D ; chaque résidu est attribué à une classe structurale selon son emplacement (hélice, boucle, feuillet), son environnement (polaire, non polaire). Une banque de structures de référence est consultée afin d’obtenir un score pour chacun des 20 acides aminés. Les scores varient entre -10 et +10 (bowie et al. 91, Luethy et al.,92), l’idéal étant d’obtenir le maximum de scores positifs.