Validation du mimétisme structural

1) Sur le site A de l’ARN 16S d’E. coli

Pour tester la fixation du DACP sur le site A de l’ARN 16S d’E. coli, nous avons suivi les variations des déplacements chimiques des protons imino de l’ARN en fonction de l’ajout de quantités croissantes de DACP. Les protons imino des bases G et U, situés au centre des appariements Watson-Crick, s’échangent très rapidement avec l’eau. Ils ne sont observables que si la paire de base est formée. Leur déplacement chimique très décalé (aux alentours de 13 ppm) permet de les observer en RMN à une dimension. L’ARN utilisé est un ARN tige boucle synthétique mimant le site A de l’ARN 16S. Cet ARN a été synthétisé à façon chez Dharmacon puis déprotégé et dialysé au laboratoire. Lorsqu’on titre l’ARN par le DACP, on observe des variations des déplacements chimiques des protons iminos ainsi qu’un élargissement de ces pics, indiquant une fixation du DACP sur l’ARN. La figure 27 montre ces effets pour un rapport ARN:DACP de 1 pour 4. Les variations de déplacement chimique sont plus importantes pour les bases U1490, G1405, G1494, G1491. Cette même empreinte de fixation a été observée pour la désoxystreptamine sur le site A (Fourmy et al. 1996). Le DACP et la DOS se fixent donc dans la même région du site A de l’ARN. Le DACP constitue donc bien un analogue structural valide de la DOS.

Figure 27 : Variations des déplacements chimiques des protons iminos du site A de l’ARN 16S. En bas spectre de l’ARN seul (0,5mM), en haut : spectre de l’ARN mélangé avec 4 équivalents de DACP (2mM). A droite : structure de l’oligoribonucléotide synthétique utilisé

mimant le site A, la numérotation correspond à celle de l’ARN 16S entier.

2) Sur l’enzyme de résistance à large spectre : l’AAC(6’)-Ib

Le mutant AAC(6’)-Ib11 est la forme de l’enzyme que nous avons étudié en premier lieu au laboratoire, ce variant possèdant le profil de substrat le plus large. Les études de fixation du DACP et le criblage pour la recherche d’inhibiteurs ont donc été réalisés avec cette forme de l’AAC(6’)-Ib dans la mesure où elle constitue la menace la plus importante en terme de profil de résistance.

Pour tester la fixation du DACP sur l’enzyme par RMN, nous avons utilisé une technique de transfert de saturation : la méthode de différence de transfert de saturation ou STD ("Saturation transfer difference") (Mayer et Meyer 2001). Cette technique utilise la différence de deux spectres. Le spectre STD lui-même est enregistré en saturant des résonances cibles ; une première expérience est effectuée en saturant une bande de fréquence de la protéine où il n’y a pas de signal du ligand (le plus souvent correspondant à la région des méthyles). Une seconde expérience témoin, où l’on irradie “hors-resonance”, c’est-à-dire loin de tous les signaux de la protéine ou du ligand, est également enregistrée. L’irradiation pendant plusieurs secondes des méthyles de la protéine conduit à une saturation de toute la protéine par diffusion de spin. La saturation est transférée aux parties liées du ligand par transfert de saturation intermoléculaire (figure 28). Dans le spectre “hors -resonance”, les intensités de tous les signaux n’ont pas changé contrairement au spectre STD où les intensités des protons liés ont diminué. Les signaux de la protéine sont supprimés par un

filtre T_1ρ et seul le ligand est observé (le filtre T_1ρutilise la différence de vitesse de relaxation du signal RMN, rapide pour les macromolécules et lente pour les petits ligands).

La soustraction du spectre irradié et du spectre “hors-resonance” donne un spectre où l’on ne voit que les signaux des protons du ligand en contact avec la protéine. Le degré de saturation des résonances du ligand dépend de la distance entre les protons impliqués et la protéine. Les protons du ligand les plus proches et les plus fortement liés à la macromolécule seront beaucoup plus saturés, et conduiront donc à un signal STD plus fort. La soustraction peut être faite de différentes manières. L’approche la plus simple consiste à soustraire manuellement les spectres après acquisition de chaque spectre séparément, mais cette approche présente des risques. En effet, des petites variations de la température de l’échantillon ou de l’homogénéité du champ magnétique peuvent conduire à des artefacts lors de la soustraction. Il est préférable que la soustraction soit faite par un cyclage de phase, seul le spectre de différence est enregistré (Zerbe 2003).

Figure 28 : Principe du STD. L’irradiation des protons des méthyles de la protéine se propage aux molécules qui se fixent sur l’enzyme (représentées en bleu foncé contrairement

aux molécules non fixées en vert) et se transmet par échange au ligand libre.

La figure 29 présente la comparaison des spectres STD obtenus pour la kanamycine et le DACP. Sur le spectre STD de la kanamycine (en bas), les intensités des pics des protons du cycle central (en position 2) représentés en rouge sur la structure de la kanamycine sont fortement augmentées par rapport au spectre référence. Ces deux protons sont donc les plus proches ou les plus fortement liés à la protéine. Le proton en position axiale (proton situé du même coté du plan du cycle que les deux amines, grisé sur la structure et le

Spectre RMN à une dimension de la protéine

Irradiation des protons des méthyles

spectre) a le signal STD le plus intense et est donc le plus en contact avec la protéine. Ces deux protons sont encadrés par des fonctions amines qui peuvent également interagir avec la protéine par des liaisons hydrogènes ou ioniques. La fixation de la kanamycine s’effectue donc principalement par le cycle DOS, par la face contenant les deux amines. Sur le spectre STD du DACP (en haut), on observe le même motif de fixation. Les deux protons entre les deux amines ont le signal STD le plus intense, particulièrement pour le proton axial (grisé sur la structure et le spectre). D’autre part, l’ajout de kanamycine dans l’échantillon contenant le mélange protéine-DACP provoque une diminution des signaux STD du DACP indiquant une fixation compétitive au même site.

Figure 29 : Comparaison des spectres STD du DACP (en haut) et de la kanamycine (en bas). Les pics des deux protons les plus proches de l’enzyme sont encadrés en rouge sur les spectres et tracés en rouge sur les structures, le proton axial, le plus proche, est grisé. Le

cycle DOS de la kanamycine est entouré en pointillés.

3) Conclusion

Nous avons donc validé l’utilisation du DACP comme mime de la désoxystreptamine sur l’enzyme de résistance AAC(6’)-Ib11 et sur le site A de l’ARN 16S bactérien, cible des aminoglycosides. Les aminoglycosides fixant d’autres ARN, la fixation du DACP a également été validée au laboratoire par Carine Tisné sur l’ARNt^Lys3 , amorce de la transcription du VIH-1 (Chung et al. 2007). Cette molécule peut donc être utilisée comme châssis moléculaire central dans la conception d’inhibiteurs de résistance ou de nouveaux antibiotiques, mimes des aminoglycosides ou plus généralement dans la conception de nouveaux ligands d’ARN. Un brevet a été déposé pour cette molécule (Bonin et al. 2004).