Validation des interactions in vitro

Une fois les ligands spécifiques identifiés par la technique du double-hybride, il est nécessaire de confirmer leurs interactions par une technique indépendante. Pour cela, nous avons décidé d’étudier la rétention des ligands marqués avec de la [35S]méthionine sur plusieurs peptides SH3 fodrine ou spectrine fusionnés à la GST. Seuls les ligands des groupes de spécificité 1 et 3 ont été étudiés à l’exception des quatre clones isolés du groupe 3 (clones 3, 32, 41 et 64) en raison de leur sous-représentativité, et de la famille 282. Les ADNc des clones ont été amplifiés par PCR avec les amorces pGAD-TIV-S et pGAD- TIV-AS puis purifiés après électrophorèse sur gel d’agarose. L’amorce pGAD-TIV-S contient la séquence du promoteur T7 immédiatement suivie d’une séquence consensus de Kozak. Dix bases supplémentaires ont été ajoutées en amont du promoteur T7 afin d’augmenter l’efficacité de la transcription. Les produits PCR obtenus ont été transcrits et traduits avec un lysat de réticulocyte contenant l'ARN polymérase T7 en présence de [35S]méthionine. La GST ou les protéines de fusion GST-SH3fod, GST-SH3spec, GST-SH3fod-α9, GST-SH3fod-α9(i) et GST-SH3spec-α9 (10 µg chacune) préalablement fixées sur des billes de Sépharose CL-4B couplées au glutathion ont été incubées en présence du produit de traduction avec ou sans détergent Nonidet NP40. Après lavage, les protéines ont été séparées par électrophorèse dénaturante sur gel d’acrylamide (12,5 %). Le gel a été ensuite séché et les interactions analysées après autoradiographie. Les résultats sont présentés sur la Figure 28 (page 121).

L’un des avantages principaux de cette technique est la possibilité de tester tous les ligands en série car les produits PCR ont été réalisés avec un couple d’amorces unique. Les autoradiographies des produits obtenus après transcription/traduction in vitro montrent que la majorité d’entre eux ont une masse moléculaire apparente plus importante que celle calculée. Ce retard de migration en SDS-PAGE peut être dû soit aux séquences riches en proline présentes dans la plupart des ligands et connues pour modifier la migration électrophorétique, soit à des modifications post-traductionnelles telles que les phosphorylations par des kinases présentes dans le lysat de réticulocytes.

Groupe 1

En ce qui concerne la LMPTP-A et la famille 306 (EST), nous n'avons pas réussi à mettre en évidence d'interaction avec le domaine SH3 de la fodrine même dans des conditions peu stringentes (sans détergent). En ce qui concerne la PTP-TD14, la protéine traduite est retenue spécifiquement sur la protéine GST-SH3fod et la protéine GST-SH3spec en présence de 0,01 % de Nonidet NP40 (Figure 28B). La présence de l’unité conformationnelle α9 de la fodrine semble renforcer l’interaction alors que ce

n’est pas le cas pour la spectrine. De manière intéressante, l’interaction semble plus forte en présence de la protéine GST-SH3fod-α9(i) reproduisant l’isoforme αIIΣ1.

Groupe 3

L’interaction de la protéine codée par l’ADNc EST 303 n’a pas pu être confirmée par cette méthode en raison de sa masse moléculaire trop petite (10,5 kDa). De même, les résultats des protéines cbl-b et WBP11 n’étaient pas satisfaisants car les protéines traduites interagissaient beaucoup plus fortement avec la GST qu’avec les autres protéines de fusion.

En revanche, la Figure 28 montre qu’il existe une interaction entre le domaine SH3 de la fodrine et les protéines KIAA1014, N-WASP, e3B1, RNB6 et Fr1. Dans certains cas, l’interaction non spécifique avec la GST reste élevée mais c’est la quantité plus importante de la protéine ligand fixée sur les protéines GST fusionnées aux domaines SH3 qui permet de confirmer les interactions sans ambiguïté (KIAA1014, Figure 28A). Il serait intéressant pour ces protéines de tester les interactions dans des conditions plus stringentes. En ce qui concerne la protéine KIAA1014, la présence de l’unité conformationnelle α9 ne semble pas renforcer l’interaction avec le domaine SH3 fodrine alors qu’elle semble diminuer l’interaction avec le domaine SH3 de la spectrine (Figure 28A). Les mêmes conclusions sont obtenues pour la protéine N-WASP. On voit même que l’interaction GST-SH3fod/N-WASP n’est détectable qu’en présence de l’unité conformationnelle α9 alors, qu’au contraire, l’unité α9 de la spectrine diminue l’interaction GST-SH3spec/N-WASP (Figure 28A).

L’interaction avec la protéine e3B1 a été testée uniquement avec les protéines GST, GST-SH3fod et GST- SH3spec. En présence de 0,01 % de Nonidet NP40, l’interaction est plus importante avec le domaine SH3 de la spectrine. En présence de 0,5 % de Nonidet NP40, seule l’interaction GST-SH3spec/e3B1 peut être observée alors que l’interaction GST-SH3fod/e3B1 est indétectable (Figure 28B). Ce résultat confirme ceux publiés par Ziemnicka-Kotula et coll. (1998) qui ont démontré que e3B1 interagissait plus spécifiquement avec le domaine SH3 de la spectrine. Enfin, l’ensemble de nos résultats démontrent l’importance des séquences protéiques adjacentes au domaine SH3.

Comme pour e3B1, l’interaction avec la protéine RNB6 est très spécifique du domaine SH3 de la spectrine comme le montrent les différences de fixation très importantes qui existent entre les peptides SH3 fodrine et spectrine.

Enfin, la protéine Fr1 est spécifique des domaines SH3 de la fodrine et de la spectrine. Une nouvelle fois, la présence de l’unité α9 de la fodrine renforce l’interaction avec la protéine Fr1. Quant au domaine SH3 spectrine, la présence de l’unité α9 ne semble pas affecter l’interaction.

Nous avons donc confirmé pour ces six partenaires qu’ils étaient capables d’interagir in vitro avec les domaines SH3 de la fodrine ou de la spectrine, ou bien encore avec les deux. Certaines interactions

démontrent que l’unité α9 renforce l’interaction entre le domaine SH3 et ces ligands, ce qui confirme l’importance de ces régions adjacentes et le contexte naturel du SH3.