Validation fonctionnelle de la fonction d’avirulence des T3Es sur AG91-25 (E6)

Dans le cadre d’une collaboration avec N. PEETERS, du LIPM Toulouse (LIPM) et B. VINATZER de VirginiaTech (ViTEC), nous avons essayé de valider expérimentalement la fonction d’avirulence supposée des 7 effecteurs de type III identifiés plus haut. Selon le modèle de Jones et Dangl (présenté en début de chapitre), la reconnaissance de l’ « effecteur d’avirulence » par la protéine R végétale déclenche l’ETI, une cascade de réponses de défense très rapides et de haute intensité, incluant une réaction hypersensible, macroscopiquement identifiable sur feuille par un brunissement et un effondrement du parenchyme cortical, qui s’accompagne d’autres manifestations physiologiques (fuite d’électrolytes, dégagement de formes réactives d’oxygène (ROS), dépôt de callose et lignine,….). Cette reconnaissance peut aussi se traduire par une forte chute de la charge bactérienne dans les tissus sans HR observable.

Dans cette étude fonctionnelle, plusieurs stratégies complémentaires ont donc été mises en œuvre, répondant chacune à une question spécifique :

1. L’inactivation de l’effecteur ciblé rend-elle la souche virulente sur E6?

Approche 1 : Des mutants défectifs simples de GMI1000 (RUN0054) ont été inoculés sur E6 (résistant) et E8 (sensible), pour comparer la progression de maladie (symptômes de flétrissement) à celle provoquée par le type sauvage (LIPM)

2. L’injection de l’effecteur dans la plante induit-elle une réponse de la plante ? Approche 2 :

Université de La Réunion 68 Dossier HDR – E. WICKER a. Une Réaction Hypersensible sur feuille ? Des agro-injections des allèles

GMI1000 de chaque T3E ont été menées sur feuille de E6 (résistant) et E8 (sensible) (LIPM)

b. Des réactions de défense induisant une diminution de la population bactérienne in planta (charge bactérienne) ? Les allèles GMI1000 de chaque T3E ont été clonés puis exprimés de façon hétérologue par Pseudomonas syringae DC3000 et Pseudomonas fluorescens EtHAn (Effector-to-Host Analyzer), et injectés dans les feuilles de E6 et E8 (ViTEC)

3.

La réponse de plante varie-t-elle selon les allèles présents dans les populations

naturelles ?

Approche 3 : Les différents allèles d’effecteurs identifiés dans les collections naturelles

EtHAn (Thomas et al. 2009)

Le système « Effector-to-Host Analyzer » est une construction incluant l’intégration de la région hrp/hrc de Pseudomonas syringae pv. syringae (codant pour le SST3) dans la bactérie du sol Pseudomonas fluorescens Pf0-1. Ce système permet d’analyser la /les fonctions in planta d’effecteurs de type III individuels.

Au cours de l’approche 1, neuf mutants simples (seul GMI1000-∆ripAZ1 était indisponible) et 18 mutants multiples ont été inoculés. Seul le mutant ∆ripAX2 est devenu virulent sur E6 et E8, et la complémentation de ce mutation a restauré l’avirulence. L’approche 2 s’est donc focalisée sur cet effecteur, ainsi que les T3Es les plus prometteurs, ripP1 et ripP2.

Les résultats actuels montrent une claire implication de ripAX2 dans l’avirulence : son absence induit une virulence de la souche, sa présence induit aussi une forte baisse de charge bactérienne dans les feuilles mais aussi dans la tige.

Les approches 2 et 3 sont encore en cours pour le cas de ripAX2 ; l’étude de ripP1 et ripP2 serait aussi prometteuse, dans le cadre d’un nouveau projet.

Dans les collections naturelles, plusieurs souches virulentes sur E6 sont porteuses de ripAX2. Plusieurs cas de figure ont été distingués :

Université de La Réunion 69 Dossier HDR – E. WICKER - D’autres possèdent l’allèle GMI1000 du gène, mais présentent des zones promotrices

très différentes des souches avirulentes (cas de RUN1744)

- Certaines souches avirulentes et virulentes partagent exactement le même allèle Par ailleurs, les résidus critiques pour l’avirulence sur aubergine cultivée restent à identifier. Le motif « Zn-Binding site » HExxH (et notamment E149, identifiés comme critiques pour l’avirulence sur S. torvum par Nahar et al. (2014)), sont conservés chez virulents et avirulents (allèle principal : HELIH). Par ailleurs certains virulents contiennent ripAX2, et l’analyse de leurs zones promotrices et allèle du gène est encore en cours…La route est peut-être encore longue sur cette belle histoire !

Ces travaux ont fait l’objet de deux stages Master (Flora Pensec en 2010, Lakshmi SUJEEUN en 2014), d’une partie de la thèse de J. GUINARD, et ont fait l’objet d’une publication de rang A, une publication soumise, et une publication en préparation.

Pensec Flora, Lebeau Aurore, Daunay MC, Chiroleu Frédéric, Guidot Alice, Wicker Emmanuel. 2015. Towards the identification of Type III effectors associated to

Ralstonia solanacearum virulence on tomato and eggplant. Phytopathology Online First [IF: 3.119 ; NC : 0]

Guinard Jérémy, Vinatzer Boris, Poussier Stéphane, Lefeuvre Pierre, and Wicker Emmanuel. 2015. Draft Genome sequence of nine strains of Ralstonia solanacearum differing in virulence to eggplant (Solanum melongena). Soumis à Genome Announcements.

J. Guinard, K. Wang, M.-C. Daunay, J.Dintinger, S. Genin, B. Vinatzer, N. Peeters, E. Wicker. 2015. The Ralstonia solanacearum Type III effector RipAX2 is conferring avirulence on the eggplant AG91-25. Mol Plant Pathol à soumettre

Les niveaux de résistance identifiés chez l’aubergine ont amené à l’hypothèse de relations gène-à-gène dans les interactions avec R. solanacearum, mais ont aussi montré l’intérêt de cette espèce comme source de résistance potentielle à d’autres bactéries phytopathogènes des Solanacées Xanthomonas euvesicatoria (Xeu) et Pseudomonas syringae pv. tomato (Pto). D’après les travaux de l’équipe de B. VINATZER (VirginiaTech, USA), Pto et Xeu sont bien pathogènes de l’aubergine ; les accessions MM195 et MM643 (respectivement E7 et E2 (Lebeau et al. 2011)) répondent par une mort cellulaire à l’infection de Pto DC3000, et bloquent la multiplication in planta de Xeu par un mécanisme n’impliquant pas la HR. La résistance de MM195 à Xeu semble d’ailleurs de nature polygénique.

Clarke C.R., Hayes B.W., Runde B.J., Wicker E., Vinatzer B.A. 2014. Eggplant and related species are promising genetic resources to dissect the plant immune response to Pseudomonas syringae and

Xanthomonas euvesicatoria and to identify new resistance determinants. Molecular plant pathology, 15 (8): 814-822. [IF: 4.485 ; NC : 0]

Université de La Réunion 70 Dossier HDR – E. WICKER

5.4 Quelles sont les forces majeures modelant l’évolution du complexe