6. RESULTATS
6.1. Validation du modèle animal
6.1.1. Tolérance à la chambre optique
L’implantation de la chambre optique est bien supportée par les animaux. Seul un lapin est mort à l’anesthésie, aucun autre accident per-opératoire et post-opératoire n’est à déplorer. Les premières photographies sont faites 2 à 3 jours après l’intervention. La formation d’un hématome sous la chambre est consécutive aux dommages infligés au tissu osseux lors de la chirurgie (Figure 30).
Figure 30: Exemple de cicatrisation du site osseux après la pose de la chambre optique
Involution de l’hématome post chirurgical visible entre J2 et J7, à J30 l’hématome a totalement disparu et un réseau vasculaire stable est établi.
Lors de la première semaine, on observe une activation en cascade de la coagulation, premier pas vers la réparation osseuse : l’activité angiogénique de cet hématome aboutit à la formation progressive de nouveaux vaisseaux, comme nous l’avons exposé dans le chapitre 2.3. C’est pourquoi, le protocole débute sur un réseau vasculaire stable signant la fin du processus de cicatrisation, au trentième jour pour notre exemple. L'analyse statistique ne retrouve pas d’influence significative du temps sur la densité vasculaire du groupe contrôle (#1) pendant tout le suivi comme on peut l’observer ci-dessous (Figure 31) :
Figure 31 : Evolution du réseau vasculaire du groupe contrôle#1
Une fois le réseau vasculaire établi et en l’absence de tout stimuli externe, une stabilité de ce dernier est observé durant les 12 semaines de l’étude.
Cependant, l’analyse des différents critères architecturaux montre une chute significative des vaisseaux de gros diamètres. Après la phase post chirurgicale, la DV du groupe #1 reste stable montrant une bonne tolérance du système d’observation et la reproductibilité des enregistrements.
6.1.2. Analyse Raman
Des spectres Raman sont enregistrés afin de caractériser la nature de l’interface chambre optique / structures sous jacentes. La chambre a été balayée au point par point en spectrométrie Raman.
Le spectre caractéristique en cas d’un tir Laser ciblé sur un vaisseau visualisable sous la chambre est le suivant (Figure 32).
1. Le spectre Raman focalisé sur la vitre (Figure 32A, spectre supérieur), ne montre pas de bande entre 600-1200 Δcm-1. Seule la bande 667 cm-1 caractérisant la silice (constituant
principal du verre) sert de repère.
2. Un second point d’analyse est ensuite focalisé sur un vaisseau sanguin visible sous la chambre (Figure 32A, spectre central). L'analyse Raman met en évidence la présence simultanée à l'échelle du micron d'hémoglobine (754 cm-1) et de la phase minérale osseuse
(bandes 1169 & 1128 cm-1 : pyrrole des érythrocytes,(Wood 2007), bandes 1002 cm-1 & 977
cm-1 : porphyrine (Ramser et coll. 2004)
3. Un troisième plan de focalisation du tir est réalisé au niveau du tissu sous jacent en dehors d’un capillaire identifiable macroscopiquement. Sur les zones éloignées des vaisseaux (Figure 32A, spectre inférieur), les bandes observées précédemment sont atténuées (1002 and 755 cm-1) voir absentes (1169 and 1128 cm-1) et les bandes caractéristiques du tissu
osseux apparaissent. La bande principale est définie par la présence des phosphates PO43- de
l’apatite à 959 et 1073 cm-1 (Penel et coll. 1998; Lakshmi et coll. 2003; Penel et al. 2005 ).
Donc, seule la signature spectrale de l'os est observée.
4. La seconde analyse (Figure 32B) présente deux spectres enregistrés sur des vaisseaux apparaissant sur différents plans. Le spectre obtenu à partir d’un vaisseau superficiel (Figure 32B, spectre inférieur) on retrouve les bandes caractéristiques de l’hémoglobine (756cm-1) et du phosphate de l’os (960 cm-1). Pour le vaisseau plus profond (Figure 32B,
Figure 32 : Caractérisation Raman de l'interface chambre / Os
Cette analyse de l’interface illustre la localisation osseuse du réseau vasculaire observé au travers de la chambre optique.
A/ Trois spectres sont obtenus en faisant varier le point d’analyse selon l’axe Z. Le premier spectre est obtenu suite à une focalisation sur la vitre. Le second spectre est le résultat d’une focalisation à l’interface. Le dernier est le plus profond tiré dans la masse osseuse.
B/ Deux spectres sont ensuite enregistrés sur des vaisseaux apparaissant sur différents plans. Le spectre obtenu à partir d’un vaisseau superficiel on retrouve les bandes caractéristiques de l’hémoglobine (756cm-1) et du phosphate de l’os (960 cm-1). Pour le vaisseau plus profond, la bande spectrale de l’os est plus marquée que celle de l’hémoglobine
6.1.3. Analyse histologique de l’interface chambre
optique/os :
La coupe de la chambre optique implantée sur la calvaria du lapin permet la mise en évidence de la bonne intégration du système d’observation en site osseux.
Sachant que la coloration utilisée marque les structures calcifiées, il n’y a pas de tissu fibreux identifiable sous la chambre. Cette coupe montre un contact intime entre la fenêtre en silice de la chambre optique et le tissu osseux (Figure 33).
Les observations réalisées se font donc en site osseux.
Figure 33 : Coupe histologique de la chambre et de son support osseux inclus en résine.
La coloration de Wolf met en évidence les structures calcifiées (en vert) en contact étroit avec la vitre de la chambre optique.
Une analyse Raman de cette coupe histologique a été réalisée au niveau de l’interface sur une zone de 5µm de large sur 35µm de hauteur (cf. Figure 34).
Os Résine Verre
2 µm 2 µm
2 µm
Image Optique
Images Raman
4 µm
Verre
Os
Figure 34: Interface Chambre Optique / Calvaria analysée par microscopie Raman en mode imagerie, taille zone analysée 5×35 µm.
A l'aide de la platine à micro déplacements XY, la zone est balayée suivant les directions X et Y, point par point par micro spectrométrie Raman. Les déplacements de la platine sont équivalents à la taille du spot d'analyse (~ 1µm). Chaque point d’analyse définit un spectre, si les bandes principales du spectre définissent le verre le point d’analyse apparaît rouge. Si les bandes prédominantes correspondent à des éléments de l‘os (phosphate, carbonate…) le point d’analyse apparaît bleu. Pour la résine, le point d’analyse prend une couleur verte. L’intensité de chaque couleur reflète la pureté du spectre. Cette analyse permet donc de caractériser la présence de verre, d’os et une interface de résine de l’ordre de 10µm au niveau de la coupe histologique.