V.1. Expression des deux protéines ExlA et ExlB en Cell-Free :
Comme montré précédemment, l’agrégation et la dégradation de la protéine ExlA a été un problème récurrent pendant cette thèse. J’ai essayé de me rapprocher encore du
contexte biologique en exprimant cette fois la totalité de l’opéron, à savoir ExlA-ExlB. Cette décision a été prise à cause de deux informations intéressantes. D’une part, il est possible que le passage de ExlA à travers ExlB permettrait le repliement correct du partenaire TpsA. En se basant sur ShlA, ou la présence du ShlB permet de rendre actif ShlA qui a été purifiée à partir
du périplasme de cellules n’exprimant pas ShlB [151]. La présence de ExlB permettrait donc
d’augmenter la stabilité d’ExlA. Le deuxième point a été prouvé par Alice Berry durant sa thèse
au PBRC dans l’équipe d’Ina Atree. En digérant avec des protéases des culots de bactéries non lysées, il a été possible de voir que ExlA était digérée à la surface des bactéries (non publié). De plus, ExlA ne serait sécrétée qu’après diminution du c-di-GMP bactérien [168]. Ceci suggère que ExlB et ExlA pourraient interagir dans le périplasme bactérien et que ExlA pourrait être accessible à l’extérieur de la bactérie.
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FIGURE 53 : Avec la courtoisie d’Alice Berry. Western-blot sur culot bactérien de souche IHMA87 traités à la protéinase K. Opr86 est une protéine présente dans la membrane externe. DsbA est une protéine périplasmique et CdrA est une protéine présente à la surface bactérienne. Il est possible de voir qu’après traitement des culots à la protease, ExlA subit le même sort que CdrA. La protéine est donc présente en surface des cellules.
L’idée a donc été d’exprimer les deux protéines en Cell-free avec ajout de liposomes,
pour purifier le potentiel complexe. L’intérêt de l’expression des deux protéines aurait été de pouvoir « pécher » la protéine ExlA complète en purifiant ExlB depuis les liposomes. Il aurait alors été possible de récupérer des informations structurales sur ce complexe en utilisant la cryo-microscopie électronique ou la cristallographie rayons-X avec cristallisation en LCP.
La séquence de la protéine ExlB a été clonée depuis le plasmide contenant l’opéron vers un pIVEX24. Les deux protéines ont ensuite été coexprimées en Cell-free avec ou sans liposomes et détergents.
FIGURE 54 : Western-BLot anti-histidine sur les tests d’expression en cell-free. Les réactions ont été réalisées en batch et ensuite centrifugées. Le culot et le surnageant ont été déposés sur gel pour être analysés en Western-blot.
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D’après les résultats, après séparation du culot d’expression Cell-free du surnageant par centrifugation, il semblerait que les deux protéines étaient bien exprimées. La condition
d’expression avec 10 CMC de Brij 58 semblait prometteuse, car une partie d’ExlA semblait soluble. Il est aussi à noter la présence d’ExlB dans le surnageant indiquant que la protéine est
bien exprimée et soluble. Evidemment ceci est préliminaire et demande à être amélioré mais les expériences ont été réalisées à la fin de ma thèse ce qui ne m’a pas laissé le temps de les finaliser. Cependant, ces données semblent prometteuses pour la suite du projet.
V.2. Expression de la protéine ExlB en bactéries :
En parallèle à l’expression Cell-Free, nous avons essayé de purifier ExlB exprimée en bactéries recombinantes. Comme indiqué dans [151] ShlB purifié permet d’activer ShlA in
vitro. Il aurait donc été intéressant de purifier ExlB à partir de la membrane externe
bactérienne d’une part pour caractériser la protéine et d’autre part pour vérifier s’il était
possible d’activer et améliorer le comportement d’ExlA in vitro.
L’expression a été faite à partir d’un clone fournit par A. Maillard du groupe d’Ina
Attree. Il comporte un tag OMP qui permet d’envoyer ExlB à la membrane externe de la cellule exprimant. Les premiers tests de solubilisation ont été produits à partir de 20 ml de cultures
E. coli de souche C43.
FIGURE 55 : SDS-PAGE de solubilisation différentielle d’ExlB. T= protéines totales exprimées par les cellules. La centrifugation 1 se fait après la lyse pour culoter les cellules non lysées. On peut voir que le culot cellulaire (cell) est chargé en protéines, indiquant que la lyse au sonicateur a été suboptimale. L’ultracentrifugation 2 a été produite à partir du lysat soluble pour séparer les membranes cellulaires des protéines solubles. Il est possible de voir que ExlB est avec les protéines membranaires culotées (P) et n’est plus dans la fraction des protéines solubles (SN). L’ultracentrifugation 3 a permis de séparer les protéines de la membrane externe (P) avec les protéines de la membrane interne bactérienne resolubilisée avec le sarkozyl (SN). ExlB est bien située avec les protéines de la membrane externe. On peut voir que ce culot repris avec du détergent OG contient bien la protéine.
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Pour purifier ExlB depuis la membrane externe de la bactérie nous avons essayé de séparer les deux membranes bactériennes en les solubilisant différemment. Une première ultracentrifugation sur le lysat a permis de récupérer les portions de membranes dans le culot. Ce culot a été repris avec du Sarkozyl pour solubiliser uniquement les protéines de la membrane interne. Après une deuxième ultracentrifugation, il a été possible de récupérer les protéines de la membrane externe non solubilisées dans le culot. ExlB fait partie de ces protéines-là comme il est possible de voir sur la Figure 55. Ce culot a été repris dans du tampon contenant du détergent OG (Octyl Glucoside) (choisi pour purifier les tonneau-β, utilisé pour les Omp [169] et FhaC [118] ) pour solubiliser ExlB et la purifier par affinité au Nickel. (Fig 55 et 56)
FIGURE 56 : SDS-PAGE de la fraction solubilisée en OG purifiée avec des billes d’affinité au Nickel. T = fraction totale. Le lavage contient les protéines non retenues par la colonne. L’élution contient bien ExlB, la protéine semble donc pouvoir être purifiée.
ExlB a donc été solubilisée par le détergent OG et est retenue sur billes de Nickel. Nous avons donc voulu aller plus loin et purifier la protéine sur un colonne SEC pour vérifier
l’homogénéité de l’échantillon. Malheureusement, la protéine s’est agrégée lors de l’étape de
concentration. Ce protocole peut être amélioré mais de la même manière que précédemment, ce sont des résultats obtenus à la fin de ma thèse. Une structure du transporteur d’ExlA aurait
été un ajout intéressant pour aider à la compréhension du fonctionnement de ce type de toxine du SST5b.
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