5.2 Encapsulation de bactéries au sein de billes poreuses pour des réactions en
5.2.3 Utilisation des billes pour des réactions en cascade enzymatique
5.2.3.2 Avec deux types de billes différentes
La réaction conduisant à la fluorescence implique trois enzymes différentes : l’aspara-ginase, l’aspartate oxidase et la peroxydase de raifort (horseradish peroxidase, HRP). Au lieu de produire uniquement l’asparaginase, des bactéries exprimant l’aspartate oxidase ont été encapsulées dans d’autres billes. Par conséquent, la réaction en cascade ne pourra avoir lieu qu’en présence de deux billes contenant des bactéries : l’une des billes contiendra des bactéries exprimant l’asparaginase et la seconde des bactéries exprimant l’aspartate oxidase (voir Figure 5.2.7).
Les billes peuvent être combinées dans différentes stoechiométries afin d’optimiser la cinétique de la réaction en cascade. Quatre stoechiométries différentes ont été testées
5.2 Encapsulation de bactéries au sein de billes poreuses pour des réactions en cascade
Figure 5.2.6 – a) Photographie de la microplaque contenant les billes classées par taille. b) histogramme de la taille des billes avec trois populations distinctes. c) activité de chaque population de billes (courbe noire pour les pe-tites tailles, courbe rouge pour les tailles moyennes et courbe bleue pour les grandes tailles) et comparée avec la suspension bactérienne (courbe orange). Contrôle négatif avec PBS (courbe brune) et billes vides (courbe verte). Les courbes présentées sont la fluorescence moyenne de chaque population ou des triplicats pour la suspension et le contrôle négatif.
allant de 1 :0 pour une bille contenant des bactéries exprimant l’asparaginase et 0 bille contenant des bactéries exprimant l’aspartate oxidase à 1 : 3 (voir Figure 5.2.8). La cinétique de réaction est accélérée avec l’augmentation de billes contenant des bactéries exprimant l’aspartate oxydase. Dans le cas d’une stoechiométrie 1 : 0, on remarque que la fluorescence augmente tout de même avec le temps. Cela est possible car les bactéries surexprimant l’asparaginase produisent tout de même de l’aspartate oxydase de manière endogène, la réaction peut donc avoir lieu mais plus lentement et sera de toute façon limitée par l’aspartate oxydase.
Figure 5.2.7 – Schéma de la réaction avec deux types de billes inoculées avec des bacté-ries exprimant différentes enzymes. L’une des billes contient des cellules
E.coli (vertes) exprimant la l-asparaginase et un deuxième type de billes contient des cellules E.coli (jaunes) exprimant l’aspartate oxydase. Le produit fluorescent n’est généré que si les deux types de billes catalysent la réaction de manière synergique.
5.3 Conclusion
Figure 5.2.8 – Mesure de la fluorescence obtenue pour les différentes stoechiométries testées : 1 : 0 (courbe noire), 1 : 1 (courbe rouge), 1 : 2 (courbe bleue), 1 : 3 (courbe verte) et contrôle négatif tampon PBS (courbe grise). Ces résultats montrent que les billes sont complètement modulables suivant la cinétique ou la réaction désirée. Notons également que les substrats et réactifs diffusent d’une bille à l’autre sans la moindre gêne.
5.3 Conclusion
Dans ce chapitre, nous avons montré que simplement en changeant la forme de nos matériaux, d’autres applications pouvaient être envisagées. Ainsi, nous avons pu immobi-liser des enzymes non plus dans des monolithes mais dans des billes macroporeuses. Ces billes sont facilement manipulables et présentent une taille plutôt homogène. En utilisant ces billes pour des réactions sous CO2 supercritique, plusieurs avantages sont apparus.
Tout d’abord, ces billes de silice sont extrêmement résistantes et contrairement à cer-tains supports polymériques, elles présentent l’avantage de résister à des pressions et des températures élevées. Deuxièmement, leur macroporosité et leur surface spécifique élevée permet une diffusion du CO2 supercritique très facile. Enfin, en comparant les résultats obtenus avec ces billes sur la synthèse d’acétate de géranyle avec les billes de référence vendues par Novozymes, nous avons pu remarquer que nos billes présentent une activité spécifique trois fois supérieure. Ces billes semblent très prometteuses pour l’immobilisation d’enzymes et leur utilisation en synthèse continue.
Dans un second temps, en s’inspirant de travaux précédents sur l’encapsulation de bactéries au sein de billes macroporeuses, nous avons pu développer des biocatalyseurs innovants. En encapsulant des bactéries surexprimant des enzymes d’intérêt, nous avons pu réaliser des réactions en cascade et réutiliser les billes sur plusieurs cycles. En utilisant ces billes en réacteur, aucune stérilisation n’est nécessaire une fois les billes retirées du milieu. Nous avons étudié ces billes sur des réactions simples d’oxydation et d’hydrolyse. Cependant, tant que les substrats, les réactifs et les produits impliqués dans les réactions sont capables de diffuser à travers la structure poreuse contenant les bactéries, tout type de réaction est envisageable.
Ces billes ouvrent des portes vers des applications multiples dans les domaines de la chimie, de l’agroalimentaire, pour la transformation de la biomasse par des enzymes ou des micro-organismes, pour la production d’énergie ou encore pour la biologie synthétique.
Conclusion et perspectives
Dans le premier chapitre, nous avons pu voir comment en s’inpirant de la nature, l’Homme a su développer des matériaux synthétiques d’exception. Nous avons décrit les différentes méthodes utilisées pour la synthèse de ces matériaux mais aussi étudié com-ment la combinaison des sciences physiques, chimiques et biologiques permet de faire avancer la recherche. Ainsi, nous nous sommes particulièrement intéressés à l’utilisation de la chimie douce et de la matière molle pour la synthèse de matériaux poreux innovants présentant de réelles applications industrielles. L’idée de cette thèse étant de comprendre et de synthétiser des nouveaux matériaux poreux innovants pour des applications en bio-catalyse. Le deuxième chapitre est consacré à l’explication des différents outils nécessaires à la synthèse et à la caractérisation de ces matériaux.
L’association des émulsions concentrées et des systèmes micellaires conduit à la forma-tion de matériaux présentant différents niveaux de porosité comme décrit dans le troisième chapitre. En ajoutant un second niveau de porosité, la structure globale des matériaux est modifiée ainsi que leurs propriétés. Bien que nous ayons montré uniquement deux voies de synthèse pour obtenir ces matériaux, il est aisé d’adapter ces voies pour obtenir les maté-riaux désirés. La mésoporosité pourra être organisée de diverses manières en utilisant des tensioactifs différents ou en jouant sur la température. Si nous avons également montré l’importance de l’ajout de sel sur la structure du matériau finale, il reste encore beaucoup d’études à effectuer pour montrer l’effet de divers agents extérieurs (nature du sel, tem-pérature, etc). On peut également envisager d’associer ces nouveaux matériaux avec les émulsions de Pickering pour ouvrir la voie vers des matériaux à porosité hiérarchisée et contrôlée dont la taille sera définie directement par l’utilisateur.
Les matériaux ont été utilisés pour l’immobilisation de différentes enzymes comme nous avons pu le voir dans le quatrième chapitre. Ainsi, en immobilisant ces entités au sein des matériaux, nous avons obtenu des matériaux hybrides. Nous avons montré qu’il est pos-sible d’immobiliser tous types d’enzymes et que les matériaux obtenus agissent comme biocatalyseurs. Grâce à leur forme monolithique, ils sont faciles à manipuler et à utili-ser pour des applications en flux continu. Ces matériaux hybrides ont été utilisés pour la
dégradation de colorants azoïques qui représente une source majeure de pollution. Contrai-rement aux biocatalyseurs d’origine polymère, il suffit également de calciner les matériaux pour éliminer toute trace de matière organique contenue à l’intérieur. Cependant, la struc-ture du matériau reste intacte et il peut être réutilisé avec de nouvelles enzymes ou pour d’autres applications. Ces matériaux se sont révelés très efficaces pour dégrader les deux colorants testés : le RBBR et le Congo Red. En revanche, il serait intéressant de réaliser une étude sur les mécanismes de dégradation afin de mieux comprendre le rôle de l’en-zyme et du médiateur. De leur côtés, B. Cui et al [208] ont montré que la dégradation du Congo Red par une laccase issue de Trametes pubescens s’effectue en plusieurs étapes. Tout d’abord, il y a réduction de la liaison du groupe azo R − N = N − R0 entraînant la formation de composés intermédiaires réactifs. Il s’ensuit alors une succession de réactions conduisant à la formation de composés stables. Les enzymes multi-cuivres sont également utilisées pour la dégradation de molécules pharmaceutiques et antibiotiques [209]. Cepen-dant, il n’existe pas d’étude sur l’utilisation de bilirubine oxydase pour la dégradation de ces molécules et les enzymes produites au laboratoire pourraient être testées afin de comparer leur efficacité et les mécanismes de dégradation vis-à-vis des laccases.
Enfin, en jouant sur la forme de nos matériaux, des billes poreuses ont été synthétisées. Ces billes ont été utilisées comme biocatalyseur pour des réactions sous CO2 supercritique et grâce à leur squelette silicique, ces billes se sont avérées résistantes et très actives par rapport aux billes commerciales habituellements utilisées. Au vu des résultats obtenus, des applications à l’échelle industrielle peuvent être envisagées. Ces billes ont également servi de matrices pour le développement de micro-organismes comme les bactéries E.
coli. A l’intérieur de ces billes, les bactéries sont capables de vivre, de se développer et sont métaboliquement actives. En associant différentes billes, nous avons pu réaliser des réactions en cascade. Chaque type de bactérie encapsulée peut réagir avec le milieu réac-tionnel et diffuser sans contamination biologique externe. Ces microbioréacteurs ouvrent la voie vers des applications dans les domaines de l’environnement, de la catalyse ou pour la production d’hydrogène. Très récemment, D. Puyol et al. [210] ont réalisé une étude sur les bactéries pourpres sulfureuses. Leur étude a montré que sous l’effet d’un courant électrique et d’un rayonnement infrarouge, ces bactéries phototrophes sont capables de convertir le carbone issu des déchets organiques tout en générant de l’hydrogène gazeux. Ces bactéries sont très prometteuses et il est tout à fait envisageable de les encapsuler au sein de billes de silice. Ces dernières contenant les enzymes pourraient être utilisées pour la production d’hydrogène sans stérilisation préalable.
En conclusion, nous avons vu que ces matériaux présentent de nombreux avantages et qu’ils peuvent être utilisés dans de nombreux domaines. Cependant, avant d’envisager des
applications industrielles ou à plus grande échelle, il est nécessaire de réaliser des études complémentaires afin d’appronfondir les résultats obtenus et de généraliser les procédés d’immobilisation et d’encapsulation à d’autres enzymes et micro-organismes.
Annexe A
Articles publiés
Ces travaux de thèse ont été valorisés dans différents articles scientifiques et un brevet listés ci-dessous :
1. Armand Roucher*, Mickaël Morvan, Deniz Pekin, Martin Depardieu, Jean-Luc Blin, Véronique Schmitt, Manfred Konrad, Jean-Christophe Baret, Rénal Backov. « From Compartmentalization of Bacteria within Inorganic Macrocellular Beads to the As-sembly of Microbial Consortia. » Advanced Biosystems, 2018, 2
2. Armand Roucher*, Ahmed Bentaleb, Eric Laurichesse, Marie-Anne Dourges, Méla-nie Emo, Véronique Schmitt, Jean-Luc Blin, Rénal Backov. « First macro-mesocellular silica SBA-15-Si (HIPE) Monoliths : conditions for obtaining self-standing mate-rials.» Chemistry of Materials, 2018, 30. Impact Factor : 9,89
3. Armand Roucher*, Mélanie Emo, François Vibert, Marie-José Stébé, Véronique Schmitt, Florian Jonas, Rénal Backov, Jean-Luc Blin. « Investigation of mixed io-nic/nonionic building blocks for the dual templating of macro-mesoporous silica.»
Journal of Colloïd and Interface Science, 2019, 533 Impact factor : 5,09
4. Armand Roucher*, Martin Depardieu, Deniz Pekin, Mickaël Morvan, Rénal Ba-ckov. « Inorganic, Hybridized and Living Macrocellular Foams :“Out of the Box” Heterogeneous Catalysis.» The Chemical Record, 2018, 18 Impact Factor : 4,89 5. Armand Roucher*, Elodie Roussarie, Régis M Gauvin, Jad Rouhana, Sébastien
Gounel, Claire Stines-Chaumeil, Nicolas Mano, Rénal Backov . « Bilirubin oxidase-based silica macrocellular robust catalyst for on line dyes degradation.», Enzyme
and Microbial Technology, 2019, 120 Impact Factor : 2,93
6. Armand Roucher*, Véronique Schmitt, Jean-Luc Blin, Rénal Backov. « Sol–gel process and complex fluids : sculpting porous matter at various lengths scales
to-wards the Si (HIPE), Si (PHIPE), and SBA-15-Si (HIPE) series.» Journal of Sol-gel
Science and Technology, 2019, Impact Factor : 1,75
7. Rénal Backov, Jean-Christophe Baret, Martin Depardieu, Deniz Pekin, Armand Roucher*, Mickaël Morvan. « SILICA FOAM BEADS, METHOD FOR PREPA-RING SAME, USE THEREOF AS BIOCATALYSTS, BIOCATALYSIS METHOD IMPLEMENTING SAID BEADS, AND OTHER USES OF SAME. » WO2018162843
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