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I.
Introduction
Cette troisième partie est consacrée à la mise au point d’une méthode pour l’évaluation de la bioaccessibilité de l’arsenic total et des différentes formes arséniées dans les produits de la pêche, en combinant une technique de lixiviation en ligne et la méthode de spéciation par couplage HPLC/ICP-MS présentée dans la deuxième partie de ce mémoire.
Après avoir décrit le principe de la méthodologie utilisée pour la lixiviation en ligne et les optimisations réalisées, nous présenterons et discuterons les résultats obtenus avec cette méthode en As total ainsi que pour les espèces arséniées dans des produits de la pêche au travers de l’article II publié dans le journal « Analytical & Bioanalytical Chemistry ». Enfin, nous présenterons également les résultats de bioaccessibilité obtenus sur d’autres éléments traces en total dans ces mêmes produits de la pêche au travers de l’article III, soumis en octobre 2011 (accepté le 12 mars 2012) dans le journal « Food Chemistry ».
II. Lixiviation en continu et spéciation de l’arsenic par couplage HPLC/ICP-
MS
II.1. Conditions expérimentales
II.1.a. Instrumentation
L’ensemble du matériel utilisé est décrit en détail dans l’Erreur ! Source du renvoi introuvable.
II.1.b. Méthodologie
La procédure de lixiviation en ligne est basée sur les travaux de Dufailly et al., (2008a). L’ensemble des étapes de la procédure de lixiviation en ligne est résumé dans la Figure 12. Le protocole se décompose en quatre étapes distinctes :
- La calibration externe réalisée par l’injection de solutions étalons à travers une boucle d’injection de 100 µL reliée au nébuliseur de l’ICP, pour la quantification de l’arsenic total bioaccessible ;
- La lixiviation en ligne de l’échantillon lyophilisé pour évaluer la quantité d’arsenic total bioaccessible en temps réel par ICP-MS ;
- La spéciation des lixiviats pour estimer la bioaccessibilité des différentes espèces d’arsenic par HPLC/ICP-MS ;
- La digestion acide des résidus par micro-ondes pour la vérification du bilan en masse (détermination de l’arsenic total non bioaccessible par ICP-MS).
Figure 12. Schéma du dispositif de lixiviation en ligne
Par rapport aux travaux de Dufailly et al., (2008a), les différentes améliorations qui ont depuis été apportées sont détaillées ci-après.
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II.1.c. Lixiviation en ligne
Initialement, la procédure consistait à introduire environ 200 mg d’échantillon lyophilisé dans un filtre Isopore (0,4 mm, 47 mm – Millipore) disposé à l’intérieur d’un tube en PTFE (8 cm de long, 3/16 de diamètre externe et 1/8 de diamètre interne). Le système était fermé par deux morceaux de laine de quartz (non tassés afin d’éviter les phénomènes de surpressions à l’intérieur de la mini-colonne) et relié au nébuliseur de l’ICP par le biais d’un tuyau en PTFE (0,8 mm de diamètre interne). L’échantillon était alors lixivié par les différents sucs digestifs (salive, suc gastrique et intestinal) maintenus à 37°C qui étaient introduits séquentiellement dans la mini- colonne à l’aide d’une pompe péristaltique afin de déterminer la bioaccessibilité de l’arsenic total. La quantification de l’arsenic total bioaccessible était réalisée par calibration externe, par l’injection de solutions étalons à travers une boucle d’injection de 100 µL montée à la place de la mini-colonne.
Lors de ces travaux, après plusieurs essais, le tube de PTFE qui constituait la mini-colonne a été remplacé par une colonne HPLC vide en inox (diamètre 3/16), et la pompe péristaltique a été remplacée par une pompe de chromatographie liquide, afin d’avoir un meilleur contrôle du débit, et d’optimiser les raccords avec la colonne pour éviter les fuites qui se produisaient fréquemment. De plus, la composition de la salive a été modifiée selon le protocole de Oomen et al., (2003), afin d’inclure l’action des enzymes sur la bioaccessibilité de l’arsenic. La composition complète de la salive est détaillée dans l’Article II.
Pour cette étape, l’acquisition des données a été réalisée en mode « temps résolu » (TRA) au rapport masse sur charge m/z = 75, et a été déclenchée manuellement au début de la lixiviation des échantillons.
II.1.d. Quantification des espèces arséniées dans les lixiviats
À l’origine, le processus de lixiviation était répété deux fois : la première fois, le lixiviat était dirigé vers le nébuliseur de l’ICP-MS pour la détermination de la bioaccessibilité de l’arsenic total ; la deuxième fois, le lixiviat d’un doublon de l’échantillon était recueilli dans un flacon pour pouvoir ensuite l’injecter dans la chaine HPLC afin de déterminer cette fois les teneurs bioaccessibles de chaque espèce d’arsenic.
Une idée simple permet désormais d’utiliser le même lixiviat : une majeure partie du volume du 1er lixiviat injecté « on-line » dans l’ICP-MS part dans le drain de la chambre de nébulisation,
qu’il suffit de récupérer dans un flacon pour l’analyse de spéciation. Cette simple modification représente un gain de temps non négligeable et permet une meilleure comparaison des résultats en total et en spéciation.
Hormis le volume d’injection qui a été diminué à 25 µL afin de réduire la quantité de sels injectée dans la colonne, les conditions chromatographiques sont identiques à celles décrites dans la deuxième partie en II.2.b.iii.
Pour la quantification des espèces arséniées, les solutions étalons (0, 1, 2, 5, 10 et 20 µg/L pour l’As(III), le MA, le DMA, l’As(V), le TMAO et l’AsC, et 0, 3, 6, 15, 30 et 60 µg/L pour l’AsB) sont analysées dans les mêmes conditions que les lixiviats (réactif digestif dilué au ½).
Pour la spéciation des lixiviats, l’acquisition des données a également été réalisée en mode TRA, avec l’utilisation de la carte « Trigger » pour synchroniser l’acquisition des données avec l’injection dans la colonne chromatographique.
II.1.e. Vérification du bilan en masse
Les résidus sont recueillis pour être minéralisés à l’aide d’un mélange HNO3/H2O (1/1)
conformément à la méthode décrite dans l’Article I.
L’acquisition des données pour l’analyse des résidus est identique à celle décrite en II.2.b.ii.
II.1.f. Optimisation du débit de nébulisation de l’ICP
Les premiers résultats ont montré une divergence entre l’arsenic total lixivié et la somme des espèces d’arsenic lixiviées : la quantité d’arsenic libérée mesurée en temps réel lors de la lixiviation était sous-estimée dans certaines matrices (parfois jusqu’à un facteur 2) (Figure 13a). Une hypothèse était que cette diminution du signal, entrainant une sous-estimation de l’arsenic libéré était due à des effets de matrices et aux sels présents dans les réactifs digestifs.
Afin de tester cette hypothèse, les lixiviats collectés ont dans un premier temps été ré-analysés en total dans les même conditions que lors des analyses en total après minéralisation (6 % HNO3,
utilisation d’étalons internes, quantification par étalonnage externe (Noel et al., 2005) afin de vérifier la teneur en arsenic total bioaccessible. Puis, les échantillons ont été lixiviés de nouveau, en faisant varier le débit de nébulisation, tout en maintenant une sensibilité satisfaisante.
Les résultats ont montré qu’avec un débit de nébulisation abaissée à 0,8 L/min, la quantité d’arsenic total libéré déterminée après lixiviation en ligne était en accord avec celle déterminée en
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ré-analysant le lixiviat en total, et également avec la somme des espèces mesurées après l’analyse de spéciation des lixiviats (Figure 13b).
Figure 13. Comparaison des résultats obtenus en fonction du débit de nébulisation pour un échantillon de crevette et un échantillon de moule.
Cette diminution contrôlée du débit de nébulisation permet donc de réduire les interférences non spectrales (effets de matrice) entraînant une sous-estimation de l’arsenic libéré. Il est intéressant de noter que Dufailly et al., (2008b) avait démontré que cette diminution du débit de nébulisation pouvait également être plus efficace que l'usage d’une chambre de collision/réaction (CCT) pour réduire un biais positif (surestimation) lié aux interférences polyatomiques à la masse
m/z = 75, notamment en présence de fortes concentrations en calcium, chlore et/ou fer dans des
matrices complexes. Ainsi, cette approche pourrait être considérée à l’avenir pour pallier ces deux grands types d’interférences en fonction des matrices analysées.
0% 20% 40% 60% 80% 100% Lixivia tion en ligne : As tota l Ana lyse du lixivia t : As tota l Spécia tion : Somme des espèces Lixivia tion en ligne : As tota l Ana lyse du lixivia t : As tota l Spécia tion : Somme des espèces A s b io a c c e ss ib le / A s to ta l ( %) Bioaccessibilité de l'As