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La mutation récessive “fragilitas ossium” (fro) découverte à l’Institut Pasteur par le groupe du Dr. Jean-Louis Guénet, est considérée comme un modèle d’OI (Guénet 1981; Aubin 2005a). Le phénotype des souriceaux fro/fro nouveaux-nés, est caractérisé par une fragilité osseuse, une absence de minéralisation des os longs, associée à un retard de croissance, des déformations osseuses en particulier au niveau des pattes postérieures, et une forte mortalité néo- et périnatale, sans mutation du collagène de type I (Muriel 1991). Cette OI s’accompagne d’une dentinogenèse imparfaite, mise en évidence par les travaux du Pr. Michel Goldberg (Faculté de chirurgie dentaire de Montrouge) (Goldberg 1996).
Les travaux de l’équipe de Jean-Louis Guénet montrent que le phénotype de la souris fro/fro est associé à une mutation du gène smpd3 codant pour la sphingomyélinase neutre de type 2 (nSMase2) (Aubin 2005b), dont l’activité enzymatique est inexistante dans les tissus des souris
fro/fro. Le phénotype de cette souris est proche de celui des souris knock-out pour smpd3
(Stöffel 2005). Cependant Stöffel ne signale pas d’OI chez les souris smpd3-/-, mais décrit des signes de chondrodysplasie chez les animaux mutants (Stöffel 2007). Ces diiférentes études indiquent une implication de la voie des shingolipides dans le développement osseux.
Des travaux réalisés au cours de mon Master 2 de Recherche sur des précurseurs d’ostéoblastes MC3T3-E1 ne montraient pas ou peu de différence de minéralisation (évaluée avec le rouge d’alizarine), entre les contrôles et les cellules traitées par un inhibiteur pharmacologique de nSMase2, le GW4869. De même, des cellules souches obtenues à partir de moelle osseuse de souris fro/fro et différenciées en ostéoblastes, montrent une diminution partielle de la minéralisation, par comparaison avec des cellules souches d’animaux “sauvages” (Fig 26A). Cependant on ne retrouve pas de diminution d’expression ni de l’activité de la phosphatase alcaline (PAL) caractéristique de la différenciation des ostéoblastes entre les souris
fro/fro et les souris contrôles (Fig 26B), indiquant donc que le défaut de minéralisation osseuse
chez les souris fro/fro, est complexe et pourrait affecter non seulement la différenciation des ostéoblastes, mais aussi d’autres voies du développement osseux.
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Figure 26 : Implication de la nSMase2 dans la minéralisation. (A) Comparaison de la coloration au rouge d’alizarine du calcium dans les progéniteurs ostéoblastiques issus de la moelle osseuse de souris sauvages et fro/fro différenciés dans un milieu ostéogénique en ostéoblastes. (B) Mesure de l’activité phosphatase alcaline (PAL) dans les progéniteurs ostéoblastiques issus de la moelle osseuse de souris sauvages et fro/fro différenciés dans un milieu ostéogénique en ostéoblastes en présence ou non de GW4869 (5µM).
Le groupe de Murshed (Khavandgar 2011) a développé une souris corrigée sur la nSMase2, exprimant smpd3 sur un promoteur de Col1A1 spécifique des ostéoblastes et des odontoblastes (souris fro/fro; Col1a1-Smpd3). Cette souris montre une restauration partielle du phénotype osseux de la souris fro/fro, et du défaut de minéralisation, confirmant le rôle de la nSMase2 dans le développement de l’os.
A côté du défaut de minéralisation, caractéristique du phénotype OI de la souris fro/fro, les travaux de Khavandgar (Khavandgar 2011) montrent également une accumulation de chondrocytes hypertrophiques avec un déficit d’apoptose dans la plaque de croissance des os longs chez les souriceaux fro/fro nouveau-nés, suggérant une anomalie de développement de l’os endochondral chez ces souris.
Ce déficit d’apoptose pourrait être la conséquence directe de la mutation de nSMase2 dont le rôle pro-apoptotique est largement rapporté dans la littérature (Castillo 2007; Golkorn 1998). Les objectifs de ce travail de thèse ont été orientés vers l’étude du rôle de la nSMase2 dans la différenciation, la maturation et l’apoptose des chondrocytes au cours du développement de la plaque de croissance chez la souris fro/fro comparée à la souris sauvage.
B
A
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Ce travail expérimental est subdivisé en trois parties:
- Dans la première partie, nous étudions l’implication de la nSMase2 dans l’apoptose des fibroblastes et des cellules différenciées en chondrocytes hypertrophiques soit soumis à des agents de stress, soit placés dans des conditions de privation en nutriments (qui mime les conditions de maturation des chondrocytes hypertrophiques).
- Dans la deuxième partie, nous rapportons les caractéristiques des chondrocytes hypertrophiques qui s’accumulent dans la plaque de croissance des os longs chez la souris
fro/fro. Nous mettons en évidence le déficit de maturation de ces cellules, caractérisé entre
autres par une absence d’expression du VEGF et de la métalloprotéase MMP13, ainsi que par un défaut d’apoptose et d’autophagie.
- La troisième partie de ce travail montre que la chondrodysplasie observée chez la souris
fro/fro, est de type “campomélique”, avec un défaut d’expression de Col2A1 et d’Acan ainsi
que de Sox9, qui est retrouvé sur des modèles de chondrocytes en culture (ATDC5, C3H10T1/2), différenciés en présence de l’inhibiteur de nSMase2, le GW4869.
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4.1. Implication de la nSMase2 dans l’apoptose induite par la privation en nutriments
4.1.1. Sphingomyélinase et apoptose
Les sphingomyélinases sont impliquées dans le catabolisme de la sphingomyéline, un sphingolipide constituant majeur des membranes plasmiques, des rafts et des cavéoles (Cremesti 2002; Clarke 2006). La dégradation de la sphingomyéline génère du céramide, un médiateur sphingolipidique impliqué dans la différenciation cellulaire, l’autophagie et l’apoptose (Jarvis 1996; Hetz 2002; Hannun 2008). L’activation de la nSMase2 et la génération de céramide sont activées par de nombreux facteurs de stress, en particulier le stress oxydant (Cinq-Frais 2013), les LDL oxydées (Devillard 2010), le TNFα (Tellier 2007), ou la privation en nutriments. Le catabolisme du céramide conditionne la réponse cellulaire vers la prolifération ou l’apoptose, du fait de la conversion en sphingosine par les céramidases puis en sphingosine 1-phosphate (S1P), après phosphorylation de la sphingosine par les SK1 et SK2 (Maceyka 2012). La S1P est impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire, et la balance S1P/céramide pourrait orienter le devenir cellulaire vers la survie ou l’apoptose, en fonction de la nature du stress, de sa durée et de son intensité.
Les résultats précédents rapportés par l’équipe ont montré que la nSMase2 n’est pas impliquée dans l’apoptose induite par les agents de stress (stress oxydant, LDL oxydées, cytokines), et la mutation de la nSMase2 ne protège pas les cellules mutantes de la mort cellulaire induite par ces agents. De même, l’hépatotoxicité induite par l’injection de TNFα est comparable dans les souris sauvages et les souris fro/fro, et la mutation de la nSMase2 ne leur confère pas de résistance (Devillard 2010). D’autres études cependant montrent un effet protecteur de la mutation en nSMase2 contre l’apoptose induite par divers agents (Filosto 2011, Meyers-Needham 2012). De plus, les travaux de Kavandhgar et coll. (Kavandhgar 2011) montrent que les chondrocytes hypertrophiques résistent à l’apoptose dans la plaque de croissance des os longs chez les souris fro/fro. L’apoptose des chondrocytes hypertrophiques constitue une étape essentielle dans la maturation de ces cellules, et se produit dans un environnement pauvre en nutriments (Shapiro 2005), qui permet l’activation de la nSMase2 et la génération de céramide (Bedia 2011).
Une hypothèse serait donc que la mutation en nSMase2 pourrait protéger les chondrocytes hypertrophiques de l’apoptose induite par la privation en nutriments chez la souris fro/fro.
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Nous avons étudié l’effet des agents de stress et de la privation en nutriments sur des fibroblastes et dans un second temps sur des chondrocytes isolés à partir de têtes fémorales de souris sauvages et fro/fro. Nos travaux présentés dans la publication jointe, montrent que la mutation de nSMase2 ne protège pas les cellules mutantes de l’apoptose induite par les agents de stress, comme déjà rapporté (Devillard 2010), mais protègerait les fibroblastes et les chondrocytes de l’apoptose induite par la privation en nutriments. Cet effet protecteur fait intervenir une surexpression de la hyaluronan synthase 2 (HAS2) et l’acide hyaluronique (HA), dont l’expression et la sécrétion sont très augmentées chez les souris fro/fro mutantes.
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4.1.2. Article
Research Paper