Transformation de C reinhardtii et expression des constructions

Après linéarisation par Kpn I, ces six nouvelles constructions ont été introduites comme précédem- ment dans la souche 325 de C. reinhardtii par co- transformation avec le plasmide pASL. Les colonies indépendantes de l’arginine ont été sélectionnées sur milieu TAP gélosé.

Dans un premier temps, 25 clones arg+ _{issus de} chaque transformation ont été choisis au hasard et colorés in situ en vue de déterminer le pourcen- tage de transformants exprimant l’ARS. Avec les constructions Aox1∆1/Ars à Aox1∆5/Ars, le taux de clones ars+ _{était élevé (co-expression de 56 à} 80 %), tandis qu’il chutait à 8 % avec Aox1∆6/Ars (Tableau 6.1). Cela indique que le segment compris entre−253 et+59 (Aox1∆5/Ars) du promoteur Aox1 contient des éléments nécessaires à l’expression du gène rapporteur Ars.

Par ailleurs, pour les constructions Aox1∆1/Ars, Aox1∆3/Ars et Aox1∆6/Ars, l’ADN total des 25 clones arg+ _{a été utilisé pour amplifier la jonction} Aox1-Ars, afin de déterminer le pourcentage de cel- lules co-transformées. Les taux obtenus (de 79 à 87 % ; Tableau 6.1) étaient suffisamment élevés et ho- mogènes pour examiner les activités ARS de pools de transformants arg+.

Les niveaux d’expression de l’ARS sont en effet très différents parmi les clones obtenus au cours d’une co-transformation donnée (voir chapitre 5, Fi- gure 5.2). Cette variabilité est liée tant au caractère aléatoire de l’intégration des plasmides dans le gé- nome qu’à l’influence du voisinage du site d’inser-

CHAPITRE 6. ANALYSE DE LA STRUCTURE DU PROMOTEUR AOX1 52 1 AAGTAGTCGACGCCTGTAGACATTCTTGCGCGTCTCGCTA 40 41 CAAGTGCAAGCTTCGTAGGCGTGAGGGCGGGCGCGTTCAA 80 81 CTAGTGCGATCGACTGCTGGCAACACAAGTTGTGATTGAT 120 121 GGTGCAGTTGGCGTGCTGATGCGCGTGCAAACGTCCTCAA 160 161 CGAGTGTGTGCCTTGCTACCGCCCTGTATGACCAGAAGAC 200 201 TAACTCTGGACGTCTGCGGCACCGATATATGTTAGACGAG 240 XH OI-235-F > 241 GTGCACGGAAAAGCGCAGAACCAGCGCCCTTGTCCAGTGT 280 281 CGTATACTGGAAAACGTCCATGTGGCTGCCCCCGTGGCAA 320 321 CTGACTTCGGTGTTTTCTTGTTATAAGTTCCTGTTGGTGT 360 361 ATCAAAAGCTGCTGGTGCACCGTAGGGCGAGCGCGCCGAC 400 401 GGGATACTTCGGTGTGACCCCAGAAACCCTACAGGCGCTG 440 XH OI-429-F > 441 CCAGAATGACATCTGAAACCTTTTTGAAGAGAAATTGTGC 480 481 TTGTAGTTTGTTTCCGAGCTATTATCGTGGCCTGCGAGCA 520 521 TGGCGGTTGCGGTGGCGGTTGGGTCCGCCTGGAAGGTCGC 560 561 TTCACCAAAAGTGAGCCGGAGAGGCTTACGACTACACACA 600 601 CGAATATGAAGTGCAAAAATGAAGGGTCGTGGGTACTTAC 640 641 GGGTTCCTTGAGATTGTCAAGTGTGTTGGTTCGAGGTTTT 680 XH OI-670-F > 681 CGGCATCCCCTTCATACAGTAGCTTTCCCCCTCCTTGCCA 720 721 TGACTATGCTGTGATGCAGTTAGGTAGTTGACATTCATAC 760 761 GTACCGTGCTGCGAGGAGCGCGCACCGCCCTTGTGCACGT 800 801 ACGTCCCCAAGATGCAAGATGCAACTGTGGGGCAGGGGAG 840 841 GGGTTCTTAGCACGGAAAGAACGCGCCCAATTAATGAGCC 880 881 ACCAGAGCTGCGGTGTCGTCGAGATGACAGCGACCTAGGT 920 XH OI-898-F > 921 ACATAGGCCATCAGCGGAAGGCGGATCGCATGCCTCAGCG 960 961 CAAGGCTCAAGACATGGCTGAGTAAGTAAGGCCGGTTGAG 1000 1001 TGCTCTATGCCCTCTGCGCTTTGATCCCCGCGACGTCCCC 1040 1041 GCACACGCAGCAATTGAGCAGTTCGGTCATCAAGCCTCCC 1080 1081 AGGCGGCCGCTCGGCATCCAGGGGCTCGGCCTCGACGTGC 1120 XH OI-1111-F > 1121 AACCCGATGCGCCGTGCGAGCGGTTGGCCCACCGTGCTTC 1160 1161 TGTGCTTGAAGTTGATATCCATAGCTAGAAGTATGACGCT 1200 1201 GTAGATTACAACGTTGCGGCGGCGGTCGACACCAGTGCAT 1240 1241 CACGAACACGTCTGACGATGGTGACGGAAAGTGCCTTCCG 1280 1281 GTGCATGCAACATGTGAGCGCCTGCTCGAATCGTCTACAC 1320 XH OI-1305-F > 1321 TGGAACTTCGAAACGTATATTACTGTTCCTTTACTATAAC 1360 1361 GGCGTAAATCCTCTCTCGCACTCACTTACCCAAGAACTCA 1400 1401 ACGTTACGTCACCGTTCGATATCGCGATGCTTCAGACCGC 1440 < XH OI-1423-R 1441 ACCTATGCTTCCGGGCCTTGGGCCACACCTCGTCCCGCAA 1480 1481 TTGGGAGCCCTGGCCAGCGCTTCTCGTCTTCTGGGCTCCA 1520 1521 TA 1522

FIG. 6.2. Séquence nucléotidique de la région promo- trice du gène Aox1.Les six amorces sens (>) et l’amorce antisens (<) sont soulignées, tandis que les deux sites Sal I (GTCGAC) et les sept sites Xho I (CTCGAG) imparfaits (à un ou deux nucléotides près) retenus sont montrés sur fond gris. La TATA box (TATATTA), l’origine de transcription (T1365_{) et le codon initiateur (ATG) du gène Aox1 sont en}

caractères gras, alors que le début des séquences codantes Nrt2;3 (en haut) et Aox1 (en bas) est représenté en gris. La numérotation des nucléotides est reprise de la séquence AF537323 de GenBank.

tion sur la transcription des constructions (effets de position ; revue par Kindle 1998).

Une solution élégante à ce problème a néanmoins été mise au point par Ohresser et al. (1997). Il s’agit de récolter quelques centaines de colonies arg+ is- sues d’une même expérience de co-transformation et de les considérer comme une seule population (un pool) sans sélection préalable des transformants

porteurs de la construction chimérique. Ce procédé contourne les effets de position et dispense de ca- ractériser moléculairement les événements d’inté- gration dans des dizaines de transformants indivi- duels. Néanmoins, comme certains transformants arg+ n’ont pas intégré de construction chimérique (ou l’expriment peu), les activités ARS de ces pools sont généralement plus faibles que celles observées dans des clones isolés d’activité élevée (Ohresser et al. 1997 ; Loppes et Radoux 2001).

Environ 300 colonies arg+issues de chaque trans- formation ont donc été récoltées en pools et rééta- lées sur milieu TAPNH4 gélosé frais. Après trois jours, ces cellules ont été transférées et cultivées pendant 16 h en milieu TAP liquide contenant soit de l’ammonium, soit du nitrate, soit du nitrate ad- ditionné d’azoture de sodium. Les activités ARS ont ensuite été déterminées comme précédemment. Les résultats présentés à la Figure 6.3 proviennent de deux séries indépendantes de co-transformations, où chaque échantillon a été examiné en dupliquat.

En dehors de la construction Aox1∆6/Ars, qui ne donne lieu qu’à des activités ARS très faibles et non significativement différentes de celles d’un pool por- teur du plasmide pJD54 (gène Ars dépourvu de pro- moteur), l’expression de l’ARS a pu être analysée avec toutes les constructions.

La tendance générale en milieux TAPNO3 et TAPNO3 + NaN3 est une diminution de l’expres- sion en passant des plasmides Aox1∆1/Ars à Aox1-

∆5/Ars. Toutefois, les activités ARS de ces cinq constructions restent plus élevées en milieu TAPNO3 qu’en milieu TAPNH4et montrent toujours l’effet sti- mulateur de l’azoture.

Ces résultats indiquent donc que des éléments né- cessaires à la transcription et à la régulation du gène

TAB. 6.1. Taux de transformants arg+_{exprimant l’ARS} (co-expression) et de cellules co-transformées détermi- nés sur des échantillons de 25 clones obtenus avec les constructions Aox1∆1/Ars à Aox1∆6/Ars.

transf. arg+ _cellules construction exprimant l’ARS co-transf.

Aox1∆1/Ars 56 % 79 % Aox1∆2/Ars 68 % n.d. Aox1∆3/Ars 68 % 79 % Aox1∆4/Ars 60 % n.d. Aox1∆5/Ars 80 % n.d. Aox1∆6/Ars 8 % 87 %

CHAPITRE 6. ANALYSE DE LA STRUCTURE DU PROMOTEUR AOX1 53 ∆1 ∆2 ∆3 ∆4 ∆5 ∆6 0 3 6 9 12 a c ti v it é A R S ( × 1 0 2 )

FIG. 6.3. Activités ARS de pools de transformants arg+_{obtenus avec les constructions Aox1}∆_{1/Ars à Aox1-}

∆6/Ars (∆1 à ∆6) et cultivés pendant 16 h en mi- lieu TAPNH4 (cercles blancs), TAPNO3 (cercles gris) ou TAPNO3 + NaN3 (cercles noirs) liquide (4 mM ; NaN3 200µM).Chaque symbole correspond à l’activité

moyenne (nmol naph h−1_{mg prot}−1_{) de deux mesures ef-}

fectuées dans chaque expérience de co-transformation.

Ars sont présents dans le court segment (de −253 à −59) qui distingue Aox1∆5/Ars de Aox1∆6/Ars, mais que des éléments distaux sont également re- quis pour une expression maximale.

6.2

Dissection de la région 3’