Transfert de [ 3 H]CE des HDL 3 vers les fractions plasmatiques VLDL et LDL

A titre d'exemple, la présente méthode électrophorétique a été appliquée à la mesure du taux de transfert d'esters de cholestérol radioactifs des HDL₃ vers les fractions plasmatiques VLDL et LDL.

Une aliquote de 150µl de plasma total est incubée pendant 0, 4 ou 8h à 37°C en présence de HDL₃ radioactives (50 µmol/l de cholestérol) et d'iodoacétate (1,5 mmol/l) dans un volume final de 200 µl. A l'issue de l'incubation, les fractions lipoprotéiques plasmatiques sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en gradient de concentration 20-160 g/l. Les fragments de gels ont été découpés comme décrit figure 19 et leur contenu en esters de cholestérol radioactifs a été dosé comme décrit précédemment (figure 18).

Comme le montre le tableau 3-A, lorsque des incubations sont maintenues à 4°C (t = 0), 78,4 ± 2,7 % de la radioactivité totale se trouve localisée dans la bande "HDL". Durant l'incubation du plasma à 37°C, la proportion relative de la radioactivité totale dans la bande "HDL" décroît de manière significative tandis qu'elle augmente significativement dans les bandes "top gel+VLDL" et "LDL". Le contenu radioactif des bandes "intermediate" et "bottom gel" ne varie pas significativement durant l'incubation à 37°C. Dans les incubations témoins maintenues à 4°C, 11,3 ± 1,9 % de la radioactivité totale est retrouvée dans les bandes "top gel+VLDL". Cette valeur relativement élevée observée précédemment pourrait s'expliquer par une accumulation, aux points de dépôts, d'une certaine quantité de matériel radioactif lié à des lipoprotéines agrégées qui ne pénétreraient pas dans le gel de polyacrylamide.

Des expériences complémentaires effectuées avec des incubations dépourvues de VLDL indiquent que le contenu radioactif des fractions "top gel+VLDL" ne varie pas de manière significative durant l'incubation à 37°C.

Lorsqu’un volume de lipoprotéines est précoloré avec 0,5 volume de noir soudan B à 5 g/l au lieu de 1 volume, le contenu radioactif de la bande "top gel + VLDL" dans les incubations témoin est réduit à 6,4 ± 0,6 % (tableau 3-B) alors que la radioactivité retrouvée dans la fraction HDL augmente de 78,4  2,7 % à 84,5  0,3 %.

Tableau 3: Transfert de [³H]CE des HDL3 vers les autres fractions lipoprotéiques plasmatiques. Tous les mélanges d'incubation contiennent du plasma (150 l) et des [³H]CE-HDL3 (10 nmol de cholestérol) dans un volume final de 200l. Les échantillons sont soit maintenus à 4°C (t = 0) soit incubés pendant 4 ou 8 h à 37°C (t = 4 et t = 8). A l'issue de l'incubation, les échantillons sont précolorés en présence de noir soudan B (1 volume, tableau 3-A; 0,5 volume; tableau 3-B) puis soumis à électrophorèse sur gels de polyacrylamide en gradient. Les gels sont découpés et dissous par NaOCl. Les valeurs représentent la moyenne ± écart-type de 4 mesures. Les chiffres entre parenthèses indiquent le pourcentage de différence par rapport aux fragments homologues maintenus à 4°C.

3-A

Fractions Temps d'incubation à 37°C

Electrophorétiques 0 h 4 h 8 h Top Gel + VLDL 11,3 ± 1,9 a 20,6 ± 4,0 a 25,0 ± 7,1 b (+ 9,3) (+ 13,7) LDL 6,1 ± 0,6 a 19,2 ± 5,3 c 33,1 ± 6,2 d (+ 13,1) (+ 27,0) Intermediate 2,6 ± 0,4 1,6 ± 0,5 1,35 ± 0,4 HDL 78,4 ± 2,7 a 57,0 ± 9,5 c 39,2 ± 9,9 d (- 21,4) (- 39,2) Bottom Gel 1,7 ± 0,4 1,5 ± 0,3 1,5 ± 0,5 a 4h vs 0h, P < 0,01; b 8h vs 4h, P < 0,01; c 4h vs 0h, P < 0,001; d 8h vs 4h, P < 0,001 3-B

Fractions Temps d'incubation à 37°C

Electrophorétiques 0 h 4 h 8 h

Top Gel + VLDL 6,4 ± 0,6a 8,7 ± 0,3 a 9,4 ± 0,5

(+ 2,3) (+ 3,0) LDL 6,6 ± 0,4a 21,0 ± 1,5 a 29,2 ± 1,2 b (+ 14,4) (+ 32,8) Intermediate 1,3 ± 0,1 1,2 ± 0,1 1,1 ± 0,1 HDL 84,5 ± 0,3a 67,4 ± 1,4 a 58,4 ± 1,8 b (- 17,1) (- 26,1) Bottom Gel 1,2 ± 0,1 1,8 ± 0,2 2,0 ± 0,2

Cependant dans ces conditions, la localisation des fractions lipoprotéiques faiblement colorées devient plus difficile. Lorsque le taux de transfert des esters de cholestérol est calculé par différence avec les incubations témoins maintenues à 4°C, respectivement 9,3 et 13,1 % du contenu en esters de cholestérol des HDL3 sont transférés vers les VLDL et LDL après 4h d'incubation à 37°C. Après 8h d'incubation à 37°C, le taux de transfert vers les VLDL et LDL s'élève respectivement à 13,7 et 27,0 %. La différence entre les transferts vers les VLDL et vers les LDL est significative (P < 0,05). Ces données indiquent que la proportion relative des esters de cholestérol radioactifs transférés peut différer d'une fraction lipoprotéique plasmatique à une autre. Le taux de radioactivité des fragments de gels dépourvus de lipoprotéines (bandes "intermediate" et "bottom gel") demeure très faible (moins de 3 % de la radioactivité totale) durant l'incubation à 37°C.

Par conséquent, ces résultats indiquent, comme précédemment décrit (TALL

1986b), que les esters de cholestérol sont transférés spécifiquement des HDL vers les fractions VLDL et LDL.

Lorsqu'une aliquote de 10 µl du milieu d'incubation, contenant une radioactivité totale de 4732 ± 278 dpm, est appliquée sur le gel de polyacrylamide en gradient, la somme de la radioactivité dans les fractions de gel correspondantes est de respectivement 4755 ± 272, 5202 ± 259 et 5079 ± 272 pour les échantillons incubés à 37°C pendant 0, 4 ou 8h.

Ainsi, malgré le transfert d'esters de cholestérol des HDL₃ vers les fractions VLDL et LDL, la totalité de la radioactivité appliquée au gel est retrouvée après séparation électrophorétique des lipoprotéines. La radioactivité totale n'étant pas modifiée après la redistribution des esters de cholestérol radioactifs entre les diverses classes de lipoprotéines, cette technique électrophorétique permet un taux de récupération satisfaisant de chaque classe de lipoprotéines.

Afin de déterminer la précision de la méthode décrite, le taux d'esters de cholestérol radioactifs transférés des HDL3 vers les fractions VLDL+LDL durant une incubation de 4h à 37°C a été déterminée dans 16 plasmas normolipidémiques après séparation des fractions HDL et VLDL+LDL par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en gradient et par ultracentrifugation (figure 22).

Figure 22: Corrélations entre le transfert d'esters de cholestérol radioactifs des HDL 3 vers les VLDL+LDL mesuré après séparation des lipoprotéines soit par ultracentrifugation soit par fractionnement sur gels de

polyacrylamide en gradient . Des plasmas de sujets normolipidémiques sont incubés pendant 4 h à 37°C en présence de HDL _{3 radioactives (10 nmol de} cholestérol) et d'iodoacétate (concentration finale: 1,5 mmol/l) dans un volume final de 200 µl. A l'issue de l'incubation, la radioactivité des fractions

VLDL+LDL et HDL séparées soit par une ultracentrifugation unique à la densité de 1,063 g/ml (abcisses) est mesurée, soit par électrophorèse sur gel de

polyacrylamide en gradient de concentration 20-160 g/l (ordonnées). Les résultats sont calculés par comparaison avec des incubations témoins maintenues à 4°C et exprimés en pourcentage d'esters de cholestérol radioactifs transférés des HDL vers les fractions plasmatiques VLDL+LDL.

Transfert d’esters de cholestérol radioactifs des HDL

3

vers les VLDL+LDL mesuré après électrophorèse (%)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 r = 0,951; P < 0,0001

Transfert d’esters de cholestérol radioactifs des HDL3 vers les VLDL+LDL mesuré après ultracentrifugation (%)

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Les mesures faites par électrophorèse ont été réalisées comme décrit précédemment si ce n'est que les fractions "top gel+VLDL" et "LDL" ont été combinées. De manière similaire, les fractions plasmatiques VLDL+LDL et HDL ont été séparées des milieux d'incubation, par ultracentrifugation à la densité 1,063 g/ml comme décrit précédemment. Les moyennes (± écart type) des taux de transfert des esters de cholestérol mesurés, sur les 16 plasmas normolipidémiques, soit par ultracentrifugation (19,0 ± 8,8 %) soit par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (21,2 ± 8,8 %) ne diffèrent pas de manière significative (P < 0,001). En outre, l'analyse de régression linéaire met en évidence une bonne corrélation entre les deux techniques indépendantes (r  0,96  0,01, P < 0,0001) (figure 22). Une corrélation significative similaire est également observée dans l’étude réalisée sur des sujets analbuminémiques (r = 0,969; P < 0,0001).