Transfert dans un contexte ccpA

Un autre candidat que nous avons testé est le gène ccpA. CcpA est tout comme CodY un régulateur métabolique global. Ces deux gènes régulent un grand nombre de gène en commun. De plus, sur la plupart de ces gènes, la régulation par CcpA est une activation et la régulation par CodY est une répression chez B. subtilis (Shivers et al., 2006 ; Shivers et Sonenshein, 2005). Il est donc possible qu’en absence de CodY, CcpA « active trop » certains gènes. Ceci peut être néfaste pour la croissance.

Figure D.3 : Transfert de codY et ccpA dans la souche sauvage.

A. Localisation des insertions de minitransposons mariner dans le gène ccpA. Pour les différentes insertions, la lettre (K) indique qu’il s’agit une insertion de cassette conférant la résistance à la kanamycine, le chiffre indique le numéro du clone et les lettres (A) ou (C) indiquent respectivement l’orientation anti-transcrite ou co-transcrite de la cassette. La mutagenèse mariner a été effectuée sur un fragment PCR amplifié avec le couple d’oligonucléotides ccpA1/ccpA2. La répartition des différentes insertions ne semble pas indiquer l’essentialité de ccpA. B. Transfert de codY et ccpA dans la souche sauvage. L’ADN des souche R3021 (ccpA::kan1A) et R2438 (codYspc3/+) a été utilisé en tant que donneur pour la transformation de la souche sauvage R1501 (comC0). C. Vingt transformants SpcR KanR obtenus avec les ADN R3021 et R2438 donnés simultanément ont été testés par PCR pour la présence de la mutation ccpA::kan1A ou la présence de la plateforme CEP-codY+. On attend une amplification (1681 pb) avec la paire d’oligonucléotides AmiF1-kan1 seulement en présence de CEP-codY+ (panneau du haut). L’amplification avec la paire d’oligonucléotides ccpA1-ccpA2 est attendue à 2026 pb pour ccpA+ et 3363 pb pour ccpA::kan1A. M, marqueur de taille (2-log ladder)

Tout d’abord, le gène ccpA a été muté en utilisant la technique de mutagenèse mariner sur le fragment PCR CcpA1/CcpA2. Une vingtaine de clone a été sélectionnée au hasard et les insertions de 11 de ces 20 clones ont été vérifiées et localisée, et 6 ont été orientées par

PCR (figure D.3.A). Les insertions se situent tout le long du fragment ciblé. Ceci suggère que

ccpA n’est pas un gène essentiel.

La souche ccpA::kan1A a ensuite été sélectionnée pour la suite des expériences car le minitransposon est inséré dans le gène ccpA et l’inactive.

La souche sauvage a été transformée avec l’ADN chromosomique des souches

ccpA::kan1A, codYspc/+ ou les deux. Lorsqu’on transforme avec l’ADN ccpA::kan1A, on obtient un taux de transfert élevé (0,13), ce qui confirme que ccpA n’est pas un gène essentiel chez S.

pneumoniae.

Si on transforme avec l’ADN de la souche codYspc/+, on obtient un taux de transfert beaucoup plus faible (0,00055). Ceci est en accord avec l’essentialité de codY. Ce taux de transfert correspond au transfert de codY::spc et de CEP-codY-kan contenus dans la souche donatrice codYspc/+. Pour vérifier ceci, nous avons effectué la même transformation en sélectionnant SpcR et KanR. Le taux de transfert observé est équivalent. Tous les mutants ayant intégré le marqueur codY::spc ont également intégré le marqueur CEP-codY-kan.

Lorsque la souche sauvage est transformée simultanément par les ADN chromosomiques de ccpA::kan1A et codYspc/+, on s’attend si ccpA est suppresseur à un taux de transfert équivalent à celui obtenu avec l’ADN codYspc/+ seul. En effet, pour intégrer codY il faudra le transfert simultané soit de CEP-codY-kan soit de ccpA::kan1A. On observe, pour la transformation avec les ADN ccpA::kan1A et codYspc/+, un taux de transfert plus faible que pour l’ADN codYspc/+ seul. Ceci semble indiquer que ccpA est incapable de supprimer l’inviabilité des mutants codY. Ainsi, les mutants SpcR et KanR obtenus par transformation avec les deux ADN portent probablement codY::spc et CEP-codY-kan. La diminution du taux de transfert observé est probablement dûe à une compétition à l’entrée de l’ADN CEP-codY-

kan et de l’ADN ccpA::kan1A (figure D.3.B).

Pour vérifier que les clones obtenus ne sont pas des doubles mutants codY ccpA, nous avons effectué des amplifications PCR sur 20 clones issus de la transformation avec les deux ADN (figure D.3.C). Ces amplifications montrent que tous les clones ont récupéré CEP-codY-

kan et sont ccpA sauvage.

ANNEXE E : Abréviations et définitions

Abréviations :

aa : acide aminé

ACP : Acyl Carrier Protein

ACT : Aspartokinase, Chorismate mutase, TyrA Domain ADN : Acide Désoxyribonucléique

ApR : résistant à l’Ampicilline ARN : Acide Ribonucléique ATP : Adenosine Triphosphate

BCAA : Branched Chain Amino Acid ; acide aminé branché BET : Bromure d’Ethidium

BSA : Bovin Serum Albumin

CSP : Competence Stimulating Peptide DO : Densité Optique

DOC : Désoxycholate DMSO : Diméthylsulfoxyde

EDTA : Acide Ethylènediamine Tétra-Acétique EGTA : Ethylèneglycol Tétra-Acétique

EryR : résistant à l’Erythromycine

GAF : cGMP-stimulated phosphodiesterases, Adenylate cyclases, FhlA Domain GDP : Guanosine Diphosphate

CmR : résistant au Chloramphénicol GTP : Guanosine Triphosphate HD : Hydrolyse Domain HE : High Efficiency

Hex :Heteroduplex Excision ; système de réparation des mésappariements HTH : Helix-turn-Helix

IF2 : Initiation Factor 2

KanR : résistant à la Kanamycine LE : Low Efficiency

LMP : Low Melting Point MSI : Magic Spot I ; ppGpp MSII : Magic Spot II ; pppGpp

NAD : Nicotinamide Adénine Dinucléotide NovR : résistant à la Novobiocine

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

ORP : Observatoires Régionaux du Pneumocoque PBP : Penicillin Binding Protein

PCR : Polymerase Chain Reaction

PEI-cellulose : Polyethylenimine cellulose pH : potentiel Hydrogène Pi : Phosphate inorganique PMSF : Phenylmethanesulfonylfluoride ppGpp : Guanosine tetraphosphate PPi : Pyrophosphate pppGpp : Guanosine pentaphosphate RC : RNA Control

rel-spo : Domaine homologue de RelA et SpoT ; synthèse du ppGpp RifR : résistant à la Rifampicine

RLU : Relative Luminescence Unit RMP : Recombination Mediactor Protein SAS : Small Alarmone Synthetase SDS : Sodium Dodecyl Sulfate SHX : Sérine Hydroxamate SmR : résistant à la Streptomycine SpcR : résistant à la Spectinomycine SSC : Saline-Sodium Citrate

TAE : Tris Acetate EDTA tARN : ARN de transfert TBE : Tris Borate EDTA

TCS : Two Composant System ; système de transduction du signal à deux composants TGS : Thréonyl-tRNA synthetase, GTPase, SpoT Domain

TrimR : résistant au Triméthoprime WHO : World Health Organization 32

Pi : Phosphate radioactif

Définitions :

ADN processome : Ensemble de protéines prenant en charge l’ADN entrant

Compétence : Etat physiologique transitoire durant lequel les bactéries sont naturellement transformables

cup : Phénotype associé à des souches dans lesquelles la compétence est déréprimée

Pore d’entrée : Complexe multiprotéique permettant le passage de l’ADN au travers de

l’enveloppe