Traitement d'image

3.5.1 Détermination de la distance entre colloïdes

Les images sont capturées par une caméra CCD Coolsnap ES2 de chez Roper Scientic codant les images sur 12 bits (4096 niveaux de gris). Bien que le capteur de la caméra mesure 1040x 1392 pixels, compte tenu de la géométrie unidimensionnelle des chaînes étudiées nous n'utilisons que sa partie centrale (Region Of Interest (ROI) = 200*1392) de manière à atteindre une fréquence d'acquisition plus importante (27 Hz) par rapport au temps total de l'acquisition (10 s). L'utilisation d'un objectif x100 à immersion permet d'obtenir un grossissement nal tel que 1 pixel = 57 nm.

Intéressons-nous tout d'abord à la mesure des distances entre particules à partir d'une image dans le visible (g 3.14.A). Le traitement des acquisitions était initalement réalisé avec ImageJ (NIH) mais le traitement acquisition par acquisition étant très chronophage, j'ai developpé un algorithme automatisé sous Matlab. Dans les deux cas, la méthode est la même et les résultats pour une chaîne donnée sont identiques. Pour optimiser la détection du centre des billes, l'image est focalisée sur le haut des particules. Chaque bille donne alors un maximum d'intensité (donc dans les blancs) entouré d'un minimum d'intensité (donc dans les noirs). Pour discriminer les billes entre elles, on xe un seuil de niveau de gris. Chaque tache ne touchant pas le bord de l'image sera identiée comme une bille (g 3.14.B).

A

B

Une fois les billes identiées, l'étape suivante consiste à déterminer la position des centres. Pour ce faire on calcule la position moyenne d'une tache en pondérant la position de chaque pixel lui appartenant par son niveau de gris. Cette méthode permet d'atteindre une résolution inférieure à 20 nm. La gure 3.15 montre la position d'une bille collée à la surface de la lamelle : en bleu la détection par moyenne pondérée et en rouge le t de la tache blanche par un cercle. On voit que les points bleus se basant sur plus d'informations sont nettement moins dispersés. Ce traitement eectué sur toutes les images d'une acquisition permet d'obtenir la distance entre chaque paires de billes en fonction du temps et donc en fonction du champ magnétique.

−30 −20 10 0 10 20 30 −10 −5 0 5 10 pondérée centroïde position du centre en x (nm) p o si ti o n d u ce n tre e n y (n m)

Figure 3.15  Position d'une bille mesurée par la moyenne pondérée des niveaux de gris de la tache blanche et par le t de la tache par un cercle (centroïde). La largeur du nuage en x est due à la dérive du système

3.5.2 Mesure de uorescence

Dans les images en fond clair, les gels d'actine sont peu visibles, c'est la présence dans les gels de monomères d'actine liés à un uorophore qui nous permet de les voir. On peut ainsi contrôler quelle bille est couverte d'actine mais aussi l'intégrité physique des gels. On peut également comparer l'intensité émise par chaque gel, grandeur qui est liée à la quantité d'actine dans le gel.

Acquisition des images de uorescence

Après chaque acquisition, on ajuste le focus sur le plan équatorial des billes, puis on prend une image en uorescence à l'aide d'une lampe X-cite XPS-120 émettant un ash pendant

100 ms dans un ltre n◦17 de Zeiss (excitation : 485 nm, séparateur de faisceau : 510 nm,

émission : 515-565 nm). Les monomères sont liés au uorophore Alexa 488 (absorption : 495 nm, émission : 519 nm). Un exemple d'image est donné en gure 3.16.A. L'intégrité physique du gel (pas de brisure par exemple) est vériée à l'÷il durant l'analyse. La mesure

de uorescence moyenne du gel a, quant à elle, nécessité l'élaboration d'un traitement d'image avancé comprenant deux étapes, la détection du centre des particules uorescentes et la mesure d'un prol moyen.

Détermination du centre des particules dans les images de uorescence

Comme pour les images en fond clair, la première étape du traitement d'image consiste à discriminer les particules entre elles, c'est-à-dire à identier la position du centre des billes uorescentes. Cependant lorsque l'on éclaire en uorescence, ce sont les gels eux mêmes qui sont la source de lumière et il n'y a pas de minimum d'intensité entre deux billes adja- centes couvertes d'actine. La méthode du seuillage sur les niveaux de gris ne permet donc pas de les séparer (g 3.16.B). Une identication manuelle étant très chronophage (20 à 50 chaînes par échantillon contenant entre une et dix-huit billes uorescentes) il a fallu avoir recours à un traitement d'image plus poussé pour identier le centre des particules uorescentes.

A

B

Figure 3.16  A : Image de uorescence ; B : Image de uorescence après seuillage ; échelle 4 µm

Une image en niveau de gris est une matrice 2D, chaque coecient indiquant le niveau de gris d'un pixel. Une représentation 3D de l'image de la gure 3.16.A est donnée en gure 3.17.A'. Pour identier le centre des particules nous eectuons un produit de convolution entre l'image de uorescence et une matrice couronne de diamètre de l'ordre de celui des gels avant de détecter les maximums locaux sur l'image de sortie.

Pour mieux comprendre, intéressons-nous à un pixel ij en particulier. On multiplie terme à terme l'image uorescence par une matrice de même taille que l'image initiale mais ne contenant que des 0 sauf une couronne de 1 centrée sur le pixel ij et de diamètre de l'ordre de celui des gels (g 3.17.B). On somme toute les valeurs de la matrice résultat obtenant ainsi une valeur numérique que l'on attribue au pixel ij. On répète cette procédure pour tous les pixels de l'image en uorescence (en déplaçant le centre de la couronne) ce qui nous donne une nouvelle image (g 3.17.C). Il est clair que dans la nouvelle image, les valeurs maximales sont atteintes quand le pixel ij est au centre d'une bille uorescente. Il ne reste plus qu'à détecter les maximas locaux sur l'image de sortie pour obtenir la position du centre des billes.

Cette méthode est robuste à deux conditions : que l'intensité lumineuse émise par les

gels soit bien supérieure à celle émise par le fond (si le rapport Igel

produisent fréquemment) et que la uorescence des billes ne soit pas trop diérente les unes des autres. Avec de bons paramètres (temps de pause et proportion de monomères uorescents), ces deux conditions sont généralement remplies, permettant un traitement rapide des images de uorescence avec une seule intervention manuelle (renseigner le nombre de billes uorescentes par image), et une vérication nale.

B

C

A

A’

Figure 3.17  Détection du centre des billes uorescentes Quantication de la uorescence

Une fois le centre de chaque particule identié, on mesure vingt prols par bille. Ces prols sont longs de 3.4 µm (distance plus longue que l'épaisseur des gels mais raisonnable pour

ne pas sortir de la ROI) entre les angles [−π

2 ; −π 6 ] et [ π 6; π 2] (g 3.18.A) de manière à ne

pas être perturbé par la bille adjacente. On moyenne ces vingt prols pour obtenir un prol moyen. A partir de ce prol moyen, on calcule la densité de uo comme la valeur moyenne de ce prol sur l'épaisseur du gel i.e. entre r et r+e (g 3.18.B).

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 500 1000 1500 2000 2500 3000

distance au centre de la bille (µm)

F lu o re sce n ce (U .A) A B

Figure 3.18  A : Image de uorescence avec les prols, échelle 4 µm ; B : Calcul du prol de uorescence moyen, en rouge la limite de la bille et la limite du gel déterminée par l'analyse mécanique