L’ensemble des traitements de données complexes et des analyses statistiques a été réalisé
grâce au logiciel R. Sauf indication contraire, les données de morphologie ont été traitées via
R 2.15 et les données de microbiologie via R 2.12 (les fonctions utilisées n’étant pas
disponibles sur la version 2.15).
II.5.1 Le traitement des données
Les boîtes à moustaches des travaux d’adhésion II.5.1.1
Comme mentionné précédemment, les trois paramètres (taux de recouvrement, taille et
nombre des objets) issus du traitement des images d’adhésion sont analysés statistiquement.
La première étape consiste à supprimer les valeurs aberrantes. Sur certaines images, la
présence de flocs ou le manque de fiabilité du traitement d’image peut engendrer des valeurs aberrantes. Une méthode courante pour identifier ces valeurs est d’avoir recours aux boîtes à
moustache (LeGuen, 2002; Tukey, 1977). Pour chaque coupon, les trois paramètres subissent le traitement via la fonction « boxplot ». Seules les valeurs n’étant pas identifiées comme
aberrantes dans les trois cas sont conservées. Des analyses de variances sont ensuite effectuées pour comparer les données entre cisaillements ou entre matériaux.
Les matrices de distances des travaux sur le développement II.5.1.2
Pour les travaux concernant le développement du biofilm, des matrices de distances euclidiennes sont utilisées pour comparer les différents coupons. Elles sont calculées soit à partir des coordonnées des profils SSCP soit à partir des coordonnées obtenues après ACP sur les descripteurs SGLDM. Pour les données microbiologiques (profils SSCP), le package vegan 2.12.2 et la fonction « vegdist » ont été utilisés (Oksanen et al., 2011). Pour les données morphologiques (SGDLM-ACP), nous nous sommes servis de la fonction « dist ».
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II.5.2 Les analyses statistiques
Les analyses de variances II.5.2.1
Que cela soit pour les travaux d’adhésion et de développement, des analyses de variances
ont été opérées. De manière générale, la significativité a été testée à 5% près, une p-value inférieure à 0,05 permet de conclure à un effet significatif du paramètre testé.
Concernant l’adhésion, ce sont les données morphologiques qui ont été traitées. Si seules
deux conditions sont testées (deux cisaillements ou deux matériaux), nous avons utilisé des tests de Welch et de Student (Welch si les variances sont significativement différentes, Student dans le cas contraire) avec la fonction « t.test » (Cornillon, 2008). Si plus de conditions sont présentes, –ex : trois cisaillements), des ANOVA (pour « ANalysis Of VAriance ») sont pratiquées avec la fonction « anova ».
Pour les travaux sur le développement du biofilm, ce sont les données microbiologiques qui ont été testées. Le package vegan 2.12.2 et la fonction « adonis » ont été mis à contribution. Les calculs sont basés sur les matrices de distances obtenues à partir des profils SSCP comme mentionné précédemment.
Les Analyses en Composantes Principales II.5.2.2
Des Analyses en Composantes Principales (ACP) ont été utilisées. Elles permettent
d’agréger les variables décrivant les individus en les regroupant par combinaisons linéaires. L’information totale contenue dans l’ensemble des variables initiales peut ainsi être
concentrée sur un nombre réduit de nouvelles variables appelées composantes principales.
Idéalement, un maximum d’information peut être agrégé sur une ou deux composantes.
Celles-ci peuvent alors servir d’axes pour une représentation graphique des individus.
L’ACP a été opérée sur les coordonnées des profils SSCP dans le cas des travaux sur
l’adhésion. Ceci s’est fait grâce au package vegan 2.12.2 et la fonction « rda». Concernant les
travaux sur le développement, le package ade4 et la fonction « duci.pca » ont été utilisées (Chessel et al., 2004).
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La régression linéaire des travaux sur la prédation II.5.2.3
Dans les travaux sur les biofilms matures, nous examinons la corrélation entre un
comptage manuel et les paramètres issus du traitement d’image (taux de recouvrement et
nombre d’objets). Pour ce faire, la fonction « lm » de R2.15 nous a permis de tester le modèle
linéaire sur les données. Ce test est réalisé pour différents seuils de coupure du filtrage. Ce filtrage est simplement réalisé sur R en écartant des données les objets dont la taille est inférieure à la valeur choisie.
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III.1 Impact du cisaillement sur les phénomènes
d’adhésion
III.1.1 Avant-propos
Le premier objectif de ce projet de thèse a été d’étudier l’étape initiatrice de la formation
du biofilm, l’adhésion microbienne. Pour un microorganisme, le premier enjeu de cette phase
est avant tout d’atteindre le support, ce qui constitue la condition sine qua non évidente pour
adhérer à la surface de celui-ci. Une fois qu’une proximité suffisante a été établie, des liaisons vont pouvoir être créées entre le microorganisme et la surface du support. En fonction de la
force d’adhésion, deux états, l’adsorption réversible et le l’adhésion irréversible, sont
distingués (Characklis and Marshall, 1990; Stoodley et al., 2002). La théorie dite de la XDLVO explique ces phénomènes (van Oss, 1995; Wang et al., 2011). Une fois que
l’adhésion est ferme et irréversible, un véritable biofilm va pouvoir commencer à se
constituer.
Comme cela a été relevé dans la synthèse bibliographique précédente, le succès de
l’adhésion microbienne dépend de nombreux paramètres. Un des facteurs fondamentaux est le
cisaillement conditionné notamment par les paramètres hydrodynamiques dont les effets ambivalents sur l’adhésion en font un sujet très étudié. La Figure III-1 explicite l’ambiguïté de
l’effet des forces hydrodynamiques sur les phénomènes d’adhésion.
Figure III-1 : Mise en évidence de la problématique des conditions hydrodynamiques
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Avec l’augmentation des forces hydrodynamiques et de la turbulence du milieu, un
mélange plus important de la phase liquide est obtenu. Ceci permet d’augmenter la probabilité
de rencontre entre le microorganisme en suspension dans la phase liquide et le support. En ce
sens, l’augmentation des forces hydrodynamiques favorise l’adhésion microbienne. A
l’inverse, dans le même temps, une augmentation des vitesses d’écoulement est observée et
s’accompagne d’un accroissement des forces de cisaillement responsables du détachement des
microorganismes déjà fixés. Ce dernier mécanisme peut donc avoir un effet préjudiciable pour
l’adhésion microbienne. Ainsi deux impacts contradictoires sont identifiés lors de
l’augmentation des contraintes hydrodynamiques, l’un favorisant l’accès au support par
l’accroissement des phénomènes de transfert de masse, l’autre stimulant les décrochements via des cisaillements plus importants.
L’objectif de ce premier volet du projet de thèse est donc de mieux comprendre et mieux
définir l’influence de l’hydrodynamique sur l’adhésion microbienne. Il est à noter qu’une
littérature déjà riche existe sur ce sujet. Néanmoins, très peu de travaux ambitionnent de
s’intéresser à ces mécanismes en régime turbulent et en culture mixte. Nos travaux visent
ainsi à se situer à l’intersection encore très peu étudiée de plusieurs ensembles comme le
résume la Figure III-2.
Figure III-2: Originalité de la démarche des travaux d’adhésion
Dans la littérature actuelle, la plupart des études sont réalisées en souche pure et en régime laminaire. Or il existe un intérêt flagrant à l’étude des biofilms multi-espèces en régime turbulent. Le plus souvent ce sont ces conditions qui sont réunies, notamment dans les domaines de l’industrie et de l’environnement.
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Une étude à l’échelle microscopique a donc été réalisée pour mieux comprendre la
structuration aussi bien en termes de flores fixées que de quantité et de distribution spatiale des microorganismes adhérés. L’adhésion microbienne a été étudiée dans des réacteurs possédant des environnements contrôlés en testant l’effet de quatre contraintes de cisaillement
sur deux types de support. Des techniques de biologie moléculaire ont permis de caractériser les communautés microbiennes attachées. En parallèle, la microscopie à épifluorescence a
permis non seulement de quantifier l’adhésion microbienne mais aussi d’appréhender la distribution spatiale des microorganismes sur la surface du support. Le développement d’une
procédure de traitement d’image standardisée a en effet rendu possible la caractérisation
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III.1.2 Impact of shear stress on initial bacterial adhesion in a
Couette-Taylor reactor
D’après l’article en cours de soumission.
T. SAURa, E. MORINa, F. HABOUZITa, N. BERNETa, R. ESCUDIÉa*
a
INRA, UR050, Laboratoire de Biotechnologie de l’Environnement, Avenue des Etangs, F -11100 Narbonne, France
* Corresponding author: renaud.escudie@supagro.inra.fr; +33 4 68 42 51 73
Abstract III.1.2.1
The objective of this study was to assess bacterial adhesion under different shear stresses in turbulent flow and using a complex bacterial consortium. A better understanding of the mechanisms governing microbial adhesion would be useful in diverse domains such as industrial processes, medical fields or environmental biotechnologies. The impact of shear stress – ranging from 0.09 to 7.3 Pa – on polypropylene (PP) and polyvinyl chloride (PVC) was carried out in Couette-Taylor reactors to evaluate adhesion in terms of morphological and microbiological structures. Epifluorescence microscopy was used to quantitatively and qualitatively characterize adhesion. Attached bacterial communities were assessed by molecular fingerprinting profiles (CE-SSCP). High shear stresses increased the quantity of attached bacteria but also altered their spatial distribution on the substratum surface. As the shear increases, aggregates or clusters appeared and their size grown when increasing shears. Co-adhesion is likely to be involved is this process. Adhered bacterial communities also evolved gradually with the applied shear and different bacterial motilities and affinities for the substratum material could be involved in this process.
Keywords : Adhesion, shear, biofilm, cluster, bacterial community
Highlights
· Shear stress increases bacterial surface coverage.
· Shear alters the spatial distribution of bacteria on the substratum surface.
· Clusters are formed and their size increases with the shear.
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Introduction III.1.2.2
Microbial adhesion, as the first step of biofilm formation, constitutes a critical stage in biofilm development and management (Liu and Tay, 2002). This process is of great interest in a various range of domains such as environmental biotechnologies (Habimana et al., 2014; Habouzit et al., 2011; Nicolella et al., 2000), medical fields (Andrews et al., 2001; Bos et al., 1994) or industrial processes (Brugnoni et al., 2012; Florjanič and Kristl, 2011; Meylheuc et
al., 2006; Perni et al., 2006). On the one hand, a better understanding of the impact of shear stress on microbial adhesion is crucial to prevent detrimental biofilm formation and reduce associated sanitary and economic issues. On the other hand, it could help to develop and optimize beneficial biofilm systems such as in water and wastewater treatment, bioremediation and industrial biotechnology.
Hydrodynamic strengths play a key role in microbial adhesion (Busscher and van der Mei, 2006; Liu and Tay, 2002). Adhesion involves transport of bacteria to the substratum surface and their attachment on it. Hydrodynamic conditions can have an ambivalent effect on adhesion mechanisms. On the one hand, an increase in mixing efficiency and in convective transport can promote microbial adhesion as it facilitates access of bacteria to the substratum. On the other hand, high hydrodynamic strengths also trigger a shear increase and thus intensify the detachment forces. Lecuyer et al. (2011) reported not only a decreasing number of adhesion events while increasing the shear, but also an increasing number of firmly attached bacteria. Park et al. (2011) obtained the highest level of adhesion in microfluidic channel for intermediate values of shear. Thus, despite the large number of studies dealing with the impact of shear stress on adhesion coverage, many aspects remain unclear. In addition, shear can also qualitatively impact attached bacterial communities. To our knowledge, only very few studies (Habouzit et al., 2011; Rochex et al., 2008) investigated changes of communities in biofilms, exhibiting a gap in the literature. However, it could be interesting to know whether or not shear can be used to control or select bacterial communities since the adhesion step.
Microbial adhesion has also been widely reported as being possibly impacted by the substratum characteristics. Indeed, all bacteria species have their own intrinsic features determining their attachment ability. This ability is related to the substratum properties such as surface energy, hydrophobicity or roughness. In addition, the affinity of a given
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microorganism to a given substratum material plays a key role in both quantitative and qualitative properties of adhesion. Meylheuc et al. (2006) characterized different types of substrata in terms of surface energy and hydrophobicity and obtained significantly different adhesion of Listeria monocytogene depending on the substratum. Habouzit et al. (2011) investigated up to seven materials and demonstrated significant dissimilarities in surface coverage and structure of bacterial communities.
Our work was carried out in Couette Taylor reactors (CTR) basically used for adhesion (Habouzit et al., 2011) and biofilm studies (Derlon et al., 2008; Florjanič and Kristl, 2011). This kind of reactors presents many advantages. The liquid phase is completely mixed, ensuring an uniform distribution of bacteria in the bulk phase (Characklis and Marshall, 1990). The constant wall shear stress distribution makes also this reactor very relevant. Furthermore, hydrodynamic conditions and flow regimes are well-defined (Andereck et al., 1986; Kataoka, 1986) and shear stress can be precisely estimated (Racina and Kind, 2006; Rochex et al., 2008) . High Reynolds numbers can also ensure a turbulent flow.
In the literature, most of the research were devoted to the impact of shear on adhesion in pure culture and under a laminar flow (Bakker et al., 2003; Lecuyer et al., 2011; Wang et al., 2011). The novelty of this work is to investigate the adhesion process for mixed culture in a turbulent flow which is more relevant for bioprocess engineering. In industrial and man-made processes as well as in natural environments, adhesion is mediated by many different strains of microorganisms, either cooperating or competing for the surface colonization (Bos et al., 1994; Meylheuc et al., 2006). A complex and diverse inoculum seems more appropriate to mimic these issues. Besides, complex hydraulic circuits found in industrial processes make the range of encountered shears and Reynolds numbers very wide (Brugnoni et al., 2012; Lelièvre et al., 2002).
In the present work, we focused on looking at the shear stress impact on microbial adhesion in these conditions. A wide range of shear stresses, 0.09-7.3 Pa, equivalent to a range of wall shear rates of 86-7300 s-1, were tested (5,000 < Re < 72,000). Two materials were used (PP and PVC) as substratum to evaluate whether or not different impacts of the shear were obtained. Both qualitative and quantitative aspects of microbial attachment morphology were characterized as well as adhered bacterial communities.
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Materials and methods III.1.2.3
Reactor characteristics III.1.2.3.1
Annular reactors – also named Couette-Taylor reactor (CTR) – from Biosurface Technologies Cord, Bozeman, USA (model 1320LJ) were used to investigate the microbial adhesion. It consisted of a rotating inner cylinder and a non-rotating outer cylinder. The inner cylinder was driven by a motor whose rotational speed can be selected – from 25 to 350 rpm –
allowing the selection of different shear stresses. The radius of the inner cylinder (ri) and of the outer cylinder (re) were 70 and 98 mm, respectively and the gap (δ) between the two
cylinders was 28 mm. Up to 20 removable slides can be placed on the inner cylinder and they are beveled to perfectly fit slots on the inner cylinder and minimize local secondary flow. The available surface area for adhesion was 18.75 cm² (150 mm x 12.5 mm) per slide.
Two different substrata were selected based on Habouzit et al. (2011): polyvinyl chloride (PVC) and polypropylene (PP). Their characterizations, in terms of surface energy and roughness, are summed up in Tableau III-1.
Surface energies (mJ.m-²) Roughness measurements (µm)
γ γLW γAB γ- γ+ Ra Rz Rmax Rpk Rvk PP 35.6 ± 1.7 34.1 ± 1.4 1.6 ± 1.0 3.5 ± 1.1 0.2 ± 0.2 0.041 ± 0.006 0.648 ± 0.311 1.628 ± 0.453 0.110 ± 0.085 0.142 ± 0.000 PVC 51.2 ± 1.9 43.1 ± 1.5 8.1 ± 1.2 6.5 ± 1.2 2.5 ± 0.5 0.038 ± 0.001 0.553 ± 0.099 0.845 ± 0.191 0.092 ± 0.028 0.075 ± 0.014
Tableau III-1: Characterization of the two materials used as substrata: PVC and PP. γ
surface energy; γLW, Lifshitz–Van der Waals component; γAB, polar component; γ-, electron donor interaction component; γ +, electron acceptor interaction component; Ra, arithmetical average; Rz, mean peak to valley heights of five adjoining sample lengths; Rmax, distance of
the highest peak to the deepest valley of the five sections mentioned in Rz definition; Rpk, measurement of the peaks which will be the areas of most rapid wear; Rvk, oil retaining
capability of the valley.
Using an anaerobic consortium, these materials showed significant differences in the structures of adhered bacterial communities (Habouzit et al., 2011). PP also presented a higher surface coverage than PVC. It can be noted that both materials can be considered as
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smooth compared to industrial materials and differences in adhesion between PP and PVC were explained by the surface energy.
Hydrodynamics and shear stress III.1.2.3.2
Hydrodynamic conditions and flow regimes in CTR are well documented. One of the first extensive study was from Taylor (1923) where the Taylor vortex flow was described. This flow regime is characterized by the presence of superposed toroidal vortices. Other flow regimes characteristic of CTR have been well described (Andereck et al., 1986; Kataoka, 1986). The flow regime depends on two dimensionless numbers, the Reynolds number (Re) and the Taylor number (Ta):
ܴ݁ ൌఆఋ ఔ [16] ܶܽ ൌఆ భ మఋయమ ఔ [17]
where Ω is the rotational speed of the inner cylinder (rad.s-1) and ν is the kinematic
viscosity of water (m².s-1). Both numbers are often described as the ratio between inertial forces – centrifugal forces in CTR – and viscous forces. They can also be used to determine the turbulence onset.
As our aim was to study microbial adhesion under turbulent flow, determining the rotational speed from which the turbulence onset is ensured was necessary. Calculations based on literature (Andereck et al., 1986; Kataoka, 1986; Taylor, 1923) highlighted a Ta = 500 for the onset of the Turbulent Vortex Flow. Even at the lowest rotational speed of 25 rpm on our system, Ta equaled 3,245 ensuring that a turbulent flow was effective.
Wall shear stress (τ) was also well modeled in CTR. As described by Racina and Kind
(2006) and applied by Rochex et al. (2008), the following equations can be used to estimate τ:
ɒ ൌ ʹǤͳ͵ ቀೝ౨ቁ య మ ቀଵିೝ ೝቁ ళ రܴ݁ଵǤସସହ ఘఔమ ଶగమ for Re > 800 [18] ɒ ൌ ͲǤͳͳ͵ ቀೝ౨ቁ య మ ቀଵିೝ ೝቁ ళ రܴ݁ଵǤସ ఘఔమ ଶగమ for Re > 10 4 [19]
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where ρ is the density of water (kg.m-3). For the lowest available speed of 25 rpm, Re
equaled 5,131 and the shear stress on the inner cylinder was 0.09 Pa. For the highest rotational
speed of 350 rpm, τ equaled 7.3 Pa. Two intermediate shear stresses were also tested: 3.7 and
0.79 Pa which corresponded respectively to the linear and the logarithmic middle values between the highest and the lowest shears. These four shear stresses are equivalent to 86 –
787 – 3700 and 7300 s-1 shear rates.
Microbial adhesion protocol III.1.2.3.3
One day before each experiment, fresh activated sludge were collected from a wastewater treatment plant (Armissan, France). It was firstly settled and the supernatant was recovered to avoid the presence of big aggregates. The supernatant was then fed with an equal amount of yeast extract, meat extract and peptone with a ratio Chemical Oxygen Demand (COD) over Volatile Suspended Solids (VSS) of 0.1gCOD.gVSS-1. The supernatant was aerated for 24h so bacteria were able to consume the substrate and to grow. An active and concentrated inoculum was thus obtained. Before the experiment, we checked that no or only little COD remained in the inoculum to ensure that no bacterial growth occurred during the adhesion process.
Reactors and slides were sterilized with a detergent solution (RBS 35, Traitements Chimiques de Surfaces, Frelinghien, France) and rinsed with autoclaved water. Rotation of the inner cylinder was switched on at the determined speed and then the inoculum was added. After a one-hour contact time between inoculum and slides, reactors were washed out with a 30µm filtered and autoclaved outlet of the wastewater treatment plant. Eight volumes of this solution were added in one hour to wash out the planktonic bacteria. By this way, almost no bacteria remained in the liquid phase when rotation was stopped. This protocol ensured that the observed adhesion necessarily occurred when shear was applied on the slides. Slides were removed from the reactor and processed either for morphological and microbiological characterizations.
Morphological structure analysis III.1.2.3.4
III.1.2.3.4.1 Image acquisition
All the solutions used for staining slides and image acquisition were prepared with the outlet of the wastewater treatment plant. This outlet was first filtered at 0.2 µm in sterile
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conditions. This allowed to minimize changes in osmotic and ionic forces and to avoid detachment of bacteria on the substratum.
Once carefully removed from the reactor, slides were rinsed and soaked in a DAPI (4’,6
-diamidino-2-phenylindole) solution for staining. Then slides were rinsed again and glued at