Traitement de données en spectroscopie AFM

O infiltrado inflamatório de natureza crônica foi o achado mais frequente, excetuando-se um padrão misto no grupo BPCAM E1. O grupo Controle teve a intensidade da inflamação leve (80%) e reação granulomatosa consideradas ausente (60%) e leve (40%), a intensidade da fibrose intensa (60%) e número de vasos variável (Tabela 8) (Figuras 15-16). O grupo BPCAM E1 apresentou intensidade da inflamação predominantemente leve (80%), reação granulomatosa ausente (60%) e intensidade da fibrose predominantemente intensa (80%), acompanhada de pouca presença de vasos sanguíneos (60%) (Tabela 9) (Figuras 17-18). O grupo BPCAM E2 apresentou um leve infiltrado inflamatório (60%), reação granulomatosa variável, de leve a intensa, intensa fibrose (80%) e moderada quantidade de vasos sanguíneos (60%) (Tabela 9) (Figuras 19-20). As variáveis da resposta inflamatória foram submetidas a análise através de atribuição de escores a intensidade estimada (Tabela 10 a 12).

Tabela 8. Análise qualitativa da resposta inflamatória e processo cicatricial no Grupo Controle (C) Nº Suíno Tipo de Infiltrado Inflamatório Intensidade da Inflamação Intensidade Reação Granulomatosa Intensidade da fibrose graduação nº de vasos 209-C C D 0 3 1 218-C C L L 1 3 216-C C L 0 3 2 225-C C L L 3 1 208-C C L 0 2 2

Tabela 9. Análise qualitativa da resposta inflamatória e processo cicatricial no Grupo BPCAM (E1). Nº Suíno Tipo de Infiltrado Inflamatório Intensidade da Inflamação Intensidade Reação Granulomatosa Intensidade da fibrose graduação nº de vasos 223-E1 M I 0 3 1 219-E1 C L L 3 1 224-E1 C L I 2 2 220-E1 C L 0 3 2 222-E1 C L 0 3 1

Tabela 10. Análise qualitativa da resposta inflamatória e processo cicatricial no Grupo BPCAM (E2)

Nº Suíno Tipo de Infiltrado Inflamatório Intensidade da Inflamação Intensidade Reação Granulomatosa Intensidade da fibrose graduação nº de vasos 210-E2 C L I 3 1 211-E2 C L L 3 2 214-E2 C M M 2 2 215-E2 C L I 3 1 217-E2 C M L 3 2

Tipo de Infiltrado Inflamatório: C = Crônico, M = Misto

* Intensidade da Inflamação: D = Discreta 5%, (0); L = Leve 5-25%, (1); M = Moderada 25-70%, (2); I = Intensa > 70%, (3). * Intensidade da Reação Granulomatosa: 0 = Ausente (0), 1 a 5 Granulomas = Leve (1), 6 a 10 Granulomas = Moderada (2),

˃ 10 Granulomas = Intensa (3)

* Intensidade da Fibrose: 0 = Ausente, 1 = Leve, 2 = Moderada, 3 = Intensa * Graduação de vasos: 0 = Ausente, 1 = Leve, 2 = Moderado, 3 = Intensa

Tabela 11. Escores atribuídos as variáveis do processo de cicatrização Grupos/ Variáveis Tipo da Inflamação Intensidade da Inflamação Reação granulomatosa Intensidade da fibrose Graduação nº de vasos Controle 209-C C 0 0 3 1 218-C C 1 1 1 3 216-C C 1 0 3 2 225-C C 1 1 3 1 208-C C 1 0 2 2 BPCAM E1 223-E1 M 3 0 3 1 219-E1 C 1 1 3 1 224-E1 C 1 3 2 2 220-E1 C 1 0 3 2 222-E1 C 1 0 3 1 BPCAM E2 210-E2 C 1 3 3 1 211-E2 C 1 1 3 2 214-E2 C 2 2 2 2 215-E2 C 1 3 3 1 217-E2 C 2 1 3 2

Tabela 12. Estudo das proporções das variáveis do processo de cicatrização

Controle BPCAM E1 BPCAM E2

Escores/Grupos n % n % n % Inflamação 0 1 20,0 0 0,0 0 0,0 1 4 80,0 4 80,0 3 60,0 2 0 0,0 0 0,0 2 40,0 3 0 0,0 1 20,0 0 0,0 ReacGran 0 3 60,0 3 60,0 0 0,0 1 2 40,0 1 20,0 2 40,0 2 0 0,0 0 0,0 1 20,0 3 0 0,0 1 20,0 2 40,0 Fibrose 1 1 20,0 0 0,0 0 0,0 2 1 20,0 1 20,0 1 20,0 3 3 60,0 4 80,0 4 80,0 N° Vasos 1 2 40,0 3 60,0 2 40,0 2 2 40,0 2 40,0 3 60,0 3 1 20,0 0 0,0 0 0,0

Figura 15. Defeito crítico do Grupo Controle - 225 dias: Fibrose intensa da mucosa e demais camadas do colédoco. Fibrose (F); Luz do colédoco (LC). (HE, 40x)

Figura 16. Defeito crítico do Grupo Controle - 225 dias: Fibrose intensa em todas as camadas da parede ductal biliar com moderada presença de vasos sanguíneos.

Fibrose Mucosa (F); Vasos sanguineos (VS). (Masson, 40x)

LC

F

VS

Figura 17. Defeito crítico do Grupo BPCAM E1 – 150 dias: Tecido biliar com acentuada fibrose de padrão tumoriforme. Fibrose (F): Luz do Colédoco (LC). (HE, 40x)

Figura 18. Defeito crítico do Grupo BPCAM E1 - 150 dias: Tecido ductal biliar com fibrose mínima da mucosa (M) e intensa nas demais camadas (F); Destruição da camada muscular. Luz do Colédoco

(LC). (Masson, 40x)

F

LC

F

Figura 19. Defeito crítico do Grupo BPCAM E2 - 330 dias: Granulomas epitelioides em área de absorção da prótese (GE); Presença de células gigantes multinucleadas (CGM). (HE, 40x)

Figura 20. Defeito crítico do Grupo BPCAM E2 - 330 dias: Numerosas formações granulomatosas na camada muscular (G); Luz do colédoco (LC). (HE, 40x)

GE

CGM

LC

DISCUSSÃO

Os procedimentos cirúrgicos realizados sobre a via biliar extra-hepática são passíveis de complicações importantes, particularmente quando há comprometimento das artérias responsáveis pela irrigação do tecido biliar manipulado(2,16,57)_{. Neste}

estudo, o emprego de patch de membrana composta por biopolímero de cana-de- açúcar para tratamento de defeito crítico do colédoco apresentou resultados satisfatórios quando comparado a anastomose colédoco-colédoco em suínos. Inicialmente, algumas considerações devem ser feitas em relação ao modelo de estudo empregado na pesquisa. Nos animais do grupo Controle houve a secção segmentar do colédoco com extensão de 10mm, seguida de imediata implantação às bordas remanescentes. A dupla secção do colédoco produziu lesões transversais nas artérias responsáveis pela irrigação do ducto biliar principal. Nos animais dos grupos BPCAM E1 e BPCAM E2, foi produzida uma lesão na parede anterior do colédoco medindo 10mm com ressecção das bordas, a fim de determinar perda de substância. Considerando que as lesões produzidas não foram exatamente iguais, haveria um viés na análise comparativa entre os grupos Controle e experimentais (BPCAM E1 e BPCAM E2). A mesma lógica não se aplicaria à comparação entre os grupos experimentais, submetidos a mesma técnica cirúrgica, diferindo apenas no tempo de seguimento pós-operatório. Além disso, o tipo de lesão coledociana produzida nos animais dos grupos experimentais preservaram a parede ductal posterior, o que provavelmente manteve a irrigação arterial parcialmente íntegra. O potencial de complicações poderia ser menor nos grupos BPCAM E1 e BPCAM E2, o que de fato ficou comprovado ao final da pesquisa. O peso dos animais poderia ser uma variável de confusão, tanto pela dificuldade técnica na confecção das anastomoses em animais de baixo peso, quanto pela diferença de calibre do colédoco a medida que suínos mais jovens rapidamente evoluíram com ganho de massa corporal. Ficou evidente o aumento das médias dos pesos dos suínos dos grupos Controle, BPCAM E1 e BPCAM E2 (tabela 1). Em termos da análise comparativa houve diferença

significativa limítrofe entre os grupos BPCAM E1 e Controle na pesagem pré- operatória. Essa diferença não foi constatada no período da eutanásia. Por fim, houve extrema dificuldade de homogeneizar os grupos estudados, principalmente considerando a elevada taxa de mortalidade do grupo Controle, assim como a impossibilidade de acesso a procedimentos terapêuticos de elevado nível de incorporação tecnológica para o devido tratamento dos animais que cursaram com complicações pós-operatórias. Por outro lado, a divisão do grupo experimental em dois, BPCAM E1 e BPCAM E2, permitiu a comparação intragrupo e análise histológica do processo de cicatrização entre a membrana do BPCA e colédoco em tempos distintos. A pretensão de produzir dois grupos experimentais distintos foi atingida, uma vez que, houve diferença significativa no tempo de seguimento pós-operatório, apenas entre os grupos com enxertos dos biopolímeros, BPCAM E1 e BPCAM E2. Os animais dos 03 grupos estudados, Controle, BPCAM E1 e BPCAM E2, apresentaram aumento do calibre do colédoco, independentemente do tipo da intervenção realizada e do tempo transcorrido entre o procedimento cirúrgico inicial e reoperação. Essa uniformidade da dilatação coledociana, não produziu diferença entre os grupos. O aumento do calibre pode ser explicado pela resistência produzida ao fluxo biliar na área cicatrizada do ducto hepatocolédoco, nas anastomoses biliares do grupo Controle e no enxerto da membrana do biopolímero de cana-de-açúcar no grupo Experimental. A secção dupla realizada no colédoco dos animais do grupo controle, assim como a ressecção de segmento da parede anterior nos animais dos grupos BPCAM E1 e BPCAM E2 lesionam a camada muscular e consequentemente comprometem a propulsão do conteúdo biliar.

O processo cicatricial é continuo e dinâmico, o que faz a estrutura ductal ficar em remodelação até o primeiro ano. Assim, como dito previamente, as células que revestem os ductos biliares, do tipo escamoso estratificado, estão em contínuo processo de proliferação e têm a capacidade de repor facilmente o tecido lesado. A migração celular se dá a partir da borda seccionada em direção a outra e através da bioprótese, no caso do grupo Experimental. As aderências em torno da via biliar, em menor ou maior grau, foram observadas na totalidade dos animais submetidos ao enxerto da membrana do biopolímero de cana-de-açúcar, nem sempre associadas ao tempo de evolução pós-operatório(63,64)_{. Esse fato pode ter contribuído para o aumento}

da espessura da parede ductal, não representando necessariamente o diâmetro do lúmen do colédoco, como demonstrado através dos métodos diagnósticos utilizados.

Aspecto que deve ser considerado nas medidas ultrassonográficas pré e pós- cirúrgicas dos suínos, é que a medida do lúmem coledociano utiliza dois marcadores – caliper, que se deslocam 0,2mm em cada movimentação; assim, sendo o colédoco pré uma estrutura tubular muita fina (1,8-3,0mm), qualquer equívoco na exata aquisição das medidas pode determinar um viés nos resultados; este aspecto pode ser mais importante nas medidas no dia da eutanásia, considerando que o suíno vai aumentar de peso e tamanho e que todos os órgãos aumentam quase proporcionalmente, inclusive o colédoco(26-30)_{. Nesse cenário, a linha ecogênica do}

colédoco, que representa o complexo serosa/gordura em torno do ducto biliar, estará mais espessada, de maneira que a medida de um lado a outro tende a estar maior nos animais que cresceram e sobreviveram até a eutanásia; então, qualquer desvio equivocado durante a aferição da medida nesse complexo espessado refletirá nos resultados. Houve diferença nas medidas ultrassonográficas do calibre coledociano apenas entre os grupos BPCAM E1 e Controle, não havendo diferença no diâmetro ântero-posterior ultrassonográfico do fígado entre os grupos de animais tratados com membrana de BPCA e aqueles tratados com enxerto autólogo do colédoco.

Em relação ao tipo de inflamação, todos os três grupos mostraram um infiltrado inflamatório de natureza crônica, com apenas um padrão misto no grupo BPCAM E1, justificado pelo tempo da análise histológica(64,65,68)_{. A intensidade da inflamação foi}

considerada leve no grupo Controle, assim como a reação granulomatosa, que na maioria das vezes esteve ausente. Notou-se, entretanto, que a intensidade da fibrose foi predominantemente intensa, acompanhada de moderada presença de vasos sanguíneos. Esse fato poderia ser explicado pela presença de duas linhas de anastomoses coledocianas no curso do processo de cicatrização, que invariavelmente aumentam a taxa de complicações(20,54,57,106)_{. Em relação à mortalidade, o grupo}

Controle apresentou uma taxa de 50%, destacando-se a estenose da anastomose, hemorragia digestiva e embolia pulmonar entre as causas determinadas, três animais morreram precocemente em torno da primeira semana e outros dois no pós-operatório tardio, no curso do terceiro mês, por complicações secundárias à obstrução do fluxo biliar. A elevada taxa de mortalidade, excluindo a embolia pulmonar, pode estar relacionada à secção dupla do ducto colédoco e consequente risco potencializado de isquemia nas linhas de anastomoses(106,107)_{. A icterícia pós-operatória, quando}

detectada, foi comprovada por elevação das bilirrubinas e enzimas canaliculares, assim como ficou evidente uma estenose na linha da anastomose colédoco-

coledociana medindo 0,3cm, dilatação a montante das vias biliares com calibre de 1,5cm e consequente distensão da vesícula biliar. O tecido fibroso resultante da anastomose colédoco-colédoco complicada produziu considerável frequência de estreitamento ductal e consequente obstrução ao fluxo biliar no grupo Controle. Atualmente, com o aumento significativo das derivações biliodigestivas e do transplante ortotópico do fígado, vários autores estudaram as complicações estenóticas das anastomoses biliares, que às vezes são acompanhadas de vazamentos, constatando uma taxa cumulativa de 37% de complicações(41,53,54,57)_.

Esses resultados são produzidos por anastomose ducto-ductal única, inerente a técnica usual do transplante hepático, o que poderemos considerar, em caso de anastomose dupla por enxerto de segmento do colédoco, uma taxa mais elevada de complicações e efeitos adversos.

O grupo BPCAM E1 apresentou um leve infiltrado inflamatório crônico, com ausência ou leve reação granulomatosa, porém intensa fibrose foi marcante acompanhada de pouca presença de vasos sanguíneos. Em geral, o processo inflamatório de natureza aguda inicialmente é mais intenso, com redução progressiva da atividade reacional ao longo do tempo. Esses resultados são semelhantes aos obtidos com a utilização da membrana de BPCA no tratamento de feridas cutâneas em ratos(102)_{. Não foram identificados quaisquer resquícios do biopolímero de cana-}

de-açúcar na análise histológica dos ductos biliares enxertados com a membrana de BPCA tanto no grupo BPCAM E1 quanto no grupo BPCAM E2. Essa constatação está de acordo com os resultados obtidos com a utilização de biopróteses de composições distintas para reparação do ducto biliar principal. Não se sabe ao certo os efeitos do contato direto e exposição contínua da membrana de BCPA com a secreção biliar. Supostamente, poderia haver uma degradação mais rápida do biopolímero de cana- de-açúcar produzida pela bile, que tem pH alcalino e ácidos biliares na sua composição. A absorção completa da membrana do BPCA também foi observada

após 12 semanas de sua implantação em bula timpânica de ratos(88)_{. Esse fenômeno}

também foi observado quando se utilizou a membrana de BCPA em substituição da dura-máter em ratos Wister, que foi sendo absorvida progressivamente ao longo dos meses subsequentes(100)_{. O enxerto ductal extra-hepático de tubo bioabsorvível de}

polímero de ácido poliláctico e policaprolactona mostrou sua absorção quase completa no curso do quarto mês, associada à diminuição significativa da reação inflamatória(4)_{. Quando se utilizou tubo de colágeno tridimensional para substituição}

do colédoco foi notada absorção parcial da prótese ao final da quarta semana, que se tornou histologicamente indetectável a partir do terceiro mês e foi coberta por epitélio colunar simples(6)_{. O BCPA, quando utilizado sob a forma de grânulos para reparar}

defeitos críticos da calota craniana de camundongos, foi absorvido completamente ao final do quarto mês(95)_{. Houve um evento de extrusão da prótese para o lúmen do}

colédoco, entretanto esse fato produziu espessamento da parede ductal sem repercussão clínica e laboratorial, não ocorrendo qualquer indício de impedimento ao fluxo biliar. A extrusão luminal da membrana do BPCA pode ter sido ocasionada por deiscência da sua linha de implantação ou devido à resposta imunológica do próprio animal, já que se tratou de evento isolado. Esse fenômeno já foi descrito com a utilização de pericárdio bovino testado experimentalmente em cães, entretanto, contrariamente ao caso citado acima, houve impedimento ao fluxo biliar e formação de cálculos(70)_{. A frequência da migração da prótese para o interior do ducto biliar}

principal foi significativamente mais elevada quando se utilizou o biomaterial sintético e-PTFE(74)_{. Intenso bloqueio em torno do fígado e formação de abscesso hepático}

foram umas das complicações notificadas, entretanto não houve elevação das bilirrubinas. Ocorreu um quadro clínico compatível com colangite supurativa aguda secundária, confirmado por dilatação das vias biliares intra-hepáticas na ultrassonografia transoperatória e presença de secreção purulenta na cirurgia de resgate. A membrana de BPCA poderia então funcionar como corpo estranho na parede do ducto biliar, lentificando o fluxo e predispondo a contaminação bacteriana ascendente. É importante ressaltar que as complicações descritas acima poderiam ser evitadas com a colocação de stents transoperatórios, ou até mesmo, tratadas através de procedimentos endoscópicos e percutâneos após o procedimento cirúrgico. Assim, a colocação de mútiplos stents por via endoscópica sem produzir reação cicatricial se constituiu em estratégia efetiva nas estenoses biliares iatrogênicas. A colocação intraluminal desses dispositivos, entretanto, não está isenta da ocorrência de efeitos adversos, sendo descritas complicações relacionadas ao procedimento e ao dispositivo(59-62)_{. Então, as complicações pós-operatórias}

verificadas no grupo BPCAM E1 poderiam ser controladas com antibioticoterapia, manipulação percutânea e procedimentos endoscópicos. O fluxo biliar é laminar, fato que pode contribuir para retração da parede ductal reparada com biopróteses maleáveis, como a utilizada nesse experimento, produzindo consequentemente estenose cicatricial. Quando utilizada para substituição tecidual da parede arterial, a

membrana de BPCA não apresentou complicações estenóticas, provavelmente pela força da pressão sanguínea arterial exercida sobre o artefato enxertado(12)_{. A pressão}

exercida por tecidos e órgãos circunjacentes ao colédoco manipulado cirurgicamente, como também, a ausência de um artefato modelador da arquitetura ductal, tipo stent ou cateter tubular, contribuem também para contração do tecido lesado, resultando em estenose na linha de reparo do tecido coledociano.

Na análise histológica do segmento ductal dos animais do grupo BPCAM E2 foi observado o aumento da intensidade da inflamação, reação granulomatosa, intensidade da fibrose e do número de vasos. Frequentemente, os animais reoperados com maior intervalo de tempo da cirurgia inicial apresentaram reação cicatricial importante, por vezes formando uma carapaça endurecida na região epigástrica de difícil dissecção. Esses achados são compatíveis com o exuberante tecido fibrótico no sítio cirúrgico, entretanto não houve alterações das enzimas canaliculares e dilatação das vias biliares à ultrassonografia, mesmo na presença de subestenose coledociana constatada por colangiografia transoperatória. Aspecto relevante a notificar sobre a função de escoamento do fluxo biliar e da síntese hepática, além da função renal, é que não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos BPCAM E2, BPCAM E1 e Controle nas dosagens laboratoriais, GGT, BT, TGP, INR e Cr. Será possível inferir que a implantação da membrana de BCPA ou a confecção da anastomose ducto-ductal, quando bem realizadas, proporcionarão bons resultados morfofuncionais. Os achados ultrassonográficos encontrados no grupo BPCAM E2, quais sejam finos ecos do conteúdo da vesícula biliar, remetem a duas considerações. A primeira seria a necessidade da realização de colecistectomia durante a cirurgia de implantação da membrana do BPCA, que além de facilitar a dissecção e isolamento do colédoco, evitaria a possível formação de cálculos biliares vesiculares. A segunda, de caráter anatômico, observa que, no suíno, o ducto cístico tem, usualmente, uma implantação póstero-lateral direita, ao nível do terço médio do ducto biliar principal, aspecto este que invariavelmente dificulta a manipulação cirúrgica do colédoco. Numa análise comparativa com a membrana de BPCA não se pode deixar de questionar os resultados contraditórios obtidos no emprego de biomateriais sintéticos do tipo e- PTFE nos reparos das lesões do ducto biliar. Os resultados produzidos com a colocação de segmentos protéticos indicam haver melhor desempenho morfofuncional quando comparado a utilização de estrutura tubular, com patência do lúmen ductal em torno de 70% dos cães estudados(73)_{. Por outro lado, a interposição}

de prótese vascular de e-PTFE para reconstrução da via biliar em suínos apresentou leve dilatação da via biliar intra-hepática com preservação da capacidade funcional do fígado aferida através de testes laboratoriais(5)_{. A utilização de segmento de e-PTFE}

em estudo recente no colédoco de cães apresentar uma taxa elevada de complicações, fato que induziu os autores a considerarem o uso cauteloso do referido biomaterial(74)_{. A membrana do BPCA utilizada no reparo da lesão coledociana é de}

natureza compacta, ou seja, sem porosidade, pela necessidade de evitar a passagem da bile para o meio exterior. Essa opção, entretanto, constituiu um fator limitador do processo de cicatrização, uma vez que impede a penetração de macrófagos, dificultando a proliferação de fibroblastos, produção de colágeno e sua incorporação ao tecido reparado, como demonstrado por Silveira et al.(108)_{, que utilizaram}

membrana compacta com porosidade estimada de 0,06 µm em parede abdominal de ratos. A membrana compacta de BPCA utilizada como remendo na parede arterial de cães, não permitiu a invasão de fibroblastos por não possuir poros, porém as novas camadas da íntima e adventícia estavam firmemente aderidas às faces dos remendos(86)_{. Assim, considerando o conteúdo da análise supracitada, pode-se inferir}

que a utilização da membrana de BCPA apresentou menor frequência de complicações pós-operatórias em relação ao e-PTFE para tratamento desse tipo de injúria.

Em síntese, a membrana de BPCA, quando aplicada para tratamento dos defeitos críticos do colédoco, produziu sua incorporação ao tecido lesado acompanhada de reação inflamatória crônica(11,12,85,96,98,99,109,110)_{. A manutenção da}

morfologia ductal e normalidade do fluxo biliar atestam a viabilidade da membrana do BCPA como substituto parcial do tecido ductal biliar, similares aos bons resultados obtidos quando utilizada em enxertos venosos e arteriais (12,86,103)_{. Essa característica}

se compara aos resultados obtidos por biomateriais diversos, uma vez que os stents biodegradáveis PLA-BaSO4, quando utilizados para tratamento de vazamentos de ducto cístico, não produziram alterações histológicas importantes e são facilmente degradados, assim como tubos de colágenos enxertados no colédoco, que foram absorvidos e se apresentaram morfologicamente similares ao ducto biliar nativo(6,37,111)_{. Próteses tubulares compostas de polímeros de ácido láctico,}

policaprolactona e fibras de ácido poliglicólico, utilizadas para substituição total do ducto biliar principal, produziram regeneração tecidual sem vazamentos, estenoses ou fragmentos tipo corpo estranho, reforçando por similaridade da composição

química, a utilização da membrana do BPCA para o mesmo fim(4,78)_{. Além de}

apresentar bons resultados na manutenção da morfologia ductal e funcionalidade do escoamento do fluxo biliar, o biomaterial empregado nesse estudo não teve observadas clinicamente reações de citotoxidade e hipersensibilidade. Castro et al. in

vitro a baixa citoxidade da membrana do BPCA, semelhante às apresentadas por telas