Tests de Neurotoxicité

Affin de connaitre s’il y a une présence ou pas d’effet toxique de chacun des six extraits végétaux sur les cellules neuronales CAD, un test de viabilité cellulaire appelé aussi le test du MTT avait été réalisé sur ces cellules.

4.7.1. Cellules CAD

Les lignées de cellules catécholaminergiques du système nerveux central, Cath.a, avaient été obtenues par oncogenèse ciblée chez des souris transgéniques, portant un antigène de type sauvage SV40T sous contrôle transcriptionnel du promoteur tyrosine hydroxylase de rats (Suri et al., 1993). Les cellules Cath.a expriment des propriétés neuronales mais elles avaient perdu la morphologie des neurones.

Les cellules de souris (B6/D2 F1 hybrides) CAD (Cath.-a-differentiated), sont une variante de la lignée cellulaire catécholaminergique Cath.a. Les CAD avaient perdu l'oncogène immortalisant, l’antigène SV40T, et expriment des protéines spécifiques aux neurones et des

67 protéines des vésicules synaptiques telles que la b-tubuline de classe III, la GAP-43, la SNAP- 25 et la synaptotagmine qui ne sont pas exprimées chez leurs ascendants Cath.a. De plus, les cellules CAD expriment la tyrosine hydroxylase, enzymatiquement bioactive, et accumulent la L-DOPA.Bien que les deux lignées expriment la tyrosine hydroxylase biologiquement active, les cellules CAD accumulent de la L-DOPA mais manquent de dopamine, ce qui suggère que l’activité de la L-DOPA décarboxylase, qui convertit la DOPA en dopamine, pourrait être déficiente. Les cellules CAD présentent les caractéristiques biochimiques et morphologiques des neurones primaires et constituent un outil unique pour l'étude de la différenciation neuronale (Qi et al., 1997). Le dépositaire et l’auteur est le Dr D. Chikaraishi, du département de neurobiologie, Bâtiment de recherche 427G Bryan, Centre médical de l’Université Duke, Durham, Caroline du Nord, États-Unis 27710.

Dans les cellules CAD, une différenciation morphologique réversible peut être initiée par élimination du sérum ou de la protéine ajoutée de manière exogène au milieu de culture.

4.7.2. Différentiation et dédifférenciation des cellules CAD

La différenciation morphologique réversible peut être initiée par l'élimination du sérum ou de la protéine exogène ajoutée au milieu de culture. Le premier jour, les cellules commencent à mettre en place des axons. Quatre jours après la mise en culture, la plupart des cellules présentent de longs axons (Qi et al., 1997 ; Abuhamadah, 2014) (fig. 33 et 34). Dans ces conditions, les cellules CAD différenciées semblent êtres en bonne santé malgré le manque de protéines et de sérum dans le milieu. Elles peuvent être maintenues dans cet état pendant au moins 6 semaines, après quoi elles ont tendance à se décoller des flacons de culture sous forme de monocouches après une perturbation mécanique. Le détachement est probablement le résultat d'un manque de substrat approprié plutôt que de la mort des cellules car les feuilles détachées peuvent être triturées et les cellules répliquées sans sérum.En revanche, lorsque les cellules parentales Cath.a, avaient été commutées, en mode sans sérum ni protéines, elles mouraient (Qi et al., 1997). Le fait de priver les cellules CAD de sérum, réduit considérablement leur prolifération alors que l’absence des protéines dans le milieu de culture, stoppe immédiatement l'augmentation de leur nombre.

68 Figure 33. Cellules CAD indifférenciées dans un milieu contenant du sérum. Image de

contraste de phase (Abuhamadah, 2014).

Figure 34. Cellules CAD différenciées dans un milieu sans sérum montrant de longs axones. Image de contraste de phase (Abuhamadah, 2014).

69 4.7.3. Applications des cellules CAD

Les cellules CAD présentent des caractéristiques biochimiques et morphologiques des neurones primaires et fournissent un outil unique pour l'étude de la différenciation neuronale et l’étude des cellules neuronales indifférenciées.

4.7.4. Culture de cellules CAD

La culture des cellules CAD et les expériences ont été réalisées dans des installations de CL1 dans des conditions stériles. Des cellules CAD ont été cultivées à 37°C et à 5% de CO2 sur

des flacons de culture tissulaire de 75 cm2 _{(T75) (Sarstedt, Newton, NC), dans un}

milieu Dulbecco's modified eagles' medium DMEM/F-12 Media - GlutaMAX™-I (GIBCO, Grand Island, NY), additionné de 10% de sérum fœtal bovin (FBS, Sigma, St. Louis, MO).

Les cellules ont été soumises à un passage tous les 6 à 7 jours à une dilution de 1/4. Les CAD se différencient pour former des axons neuronaux dans des conditions sans sérum. Pour induire une différenciation morphologique, les cellules ont été transférées sur le même milieu sans supplément de sérum après 12-24 h.

4.7.5. Subculture de la lignée cellulaire CAD

Une fois que les cellules CAD deviennent confluentes à 80% à peu prés dans les flacons de culture, on jette le milieu de culture d’origine dans des récipients appropriés, puis on rajoute 10 ml de nouveau milieu Dulbecco's modified eagles' medium DMEM/F-12 Media- GlutaMAX™-I additionné de 10% de sérum fœtal bovin dans chaque flacon.

On déloge les cellules, adhérant aux parois des flacons, par un pipetage doux en aspirant et en injectant doucement le milieu de culture, pendant 3 minutes, pour ne pas détruire les cellules. Le contenu de chaque flacon a été récupéré et centrifugé à 1000rpm pendant 5 minutes et le surnageant était par la suite éliminé. 5ml du milieu DMEM avaient été ajouté aux cellules (culot) et c’est à partir de cette suspension que les dilutions désirées pouvaient alors être préparées.

4.7.6. Cryoconservation et stockage de la lignée cellulaire CAD

Les cultures sous-confluentes (70-80%) ont été délogées par pipetage doux ; transféré dans un tube de 15 ml et centrifugé à 200 x g pendant 5 minutes à 4°C. Le culot a été remis en suspension dans du milieu DMEM® F-12 - GlutaMAX ™ -I supplémenté avec 10% de FBS et 10% de DMSO. La suspension cellulaire a été immédiatement divisée et stockée à -80°C pendant 24 heures, puis transférée dans de l'azote liquide.

70 4.7.7. Ressuscitation de la lignée cellulaire congelée

Le flacon cryogénique de cellules CAD, conservées dans de d'azote liquide, est collecté à l’aide d’un équipement de protection approprié. Le flacon a ensuite été rapidement transféré dans un bain-marie à 37°C. Il est important de décongeler le contenu du flacon rapidement pour minimiser les dommages causés aux membranes cellulaires. L'ampoule a ensuite été nettoyée avec un mouchoir imbibé d’alcool (70%) avant l'ouverture. L'ensemble du contenu de l'ampoule est transféré dans un tube stérile de 15 ml. Du DMEM préchauffé a été ajouté aux cellules CAD pour atteindre un volume total de 10 ml. Le tube a ensuite été centrifugé à 1000 tr/min pendant 5 min. Le surnageant a été retiré et le culot a été remis en suspension dans du milieu DMEM⁄F- 12 - GlutaMAX ™ -I supplémenté avec 10% de FBS. Les cellules remises en suspension ont été cultivées à 37°C et 5% de CO2 dans des flacons de culture tissulaire de 75 cm2.

4.7.8. Test de neurotoxicité (essai du MTT ou test de viabilité cellulaire)

L'effet de divers extraits de plantes sur la viabilité des cellules CAD a été déterminé en utilisant le test du MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium).

L’anneau de tétrazolium qu’il contient est réduit, par la succinate

déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, en formazan. Ceci forme un précipité dans la mitochondrie de couleur violette. La quantité de précipité formée est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes mais également à l'activité métabolique de chaque cellule viable (Kang et al., 2005 ; Freshney, 2011).

Les cultures CAD subconfluentes (70-80%) ont été délogées par un pipetage doux puis transférées dans un tube de 15 ml et centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 minutes à 4°C. Le culot a été remis en suspension dans du milieu DMEM/F-12-GlutaMAX ™ -I supplémenté avec 10% de FBS et une série de dilutions y a été préparées. Les suspensions cellulaires ont été immédiatement étalées dans des plaques de 24 puits et remises en culture. Une série de dilution (1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 mg/ml) des extraits aqueux et méthanoliques de Anacyclus

perythrum L., de Artemisia absinthium L. et de Urtica urens L. avait été préparée en utilisant

10μl de diméthylsulfoxyde (DMSO) et de l'eau distillée comme solvant. Une fois que les cultures cellulaires étaient devenues confluentes à prés de 80%, les différentes dilutions de chaque extrait végétal avaient été placées dans des plaques de 24 puits puis incubées à 37 C° et à 5% de CO2. Après 24 heures de traitement, 50 μl de solution tampon de phosphate (PBS), pH

7,4, contenant 5 mg/ml de MTT avaient été ajouté à chaque puits et incubé à 37C° (5% de CO2)

pendant 2,5 heures. Ensuite, le contenu de chaque puits avait été récupéré et placé dans des tubes Eppendorf puis centrifugé pendant 10 min à 13000 rpm. 250 μl d'isopropanol avaient été

71 ajoutés au culot pour dissoudre les cristaux violets après les avoir rincé au PBS. La densité optique de 100 μl de chaque échantillon avait été lue par spectrophotométrie à 590 nm (Thermo Lab systems Multiskan Ascent, V1.3). La viabilité cellulaire relative a été déterminée par la quantité de MTT convertie en sel de formazan insoluble. La réduction de l'absorbance de la viabilité des échantillons a été déterminée par la réduction de l'absorbance des échantillons à diverses concentrations par rapport au témoin non traité. La viabilité cellulaire a été calculée en fonction de l’équation suivante : Viabilité% = proportion de l’absorbance de l'échantillon/absorbance du contrôle (Mohammadi et al., 2016).

Toutes les données sont présentées en moyenne ± déviation standard (SD) pour au moins 4 répétitions pour chaque échantillon préparé.