La chromatographie à laquelle il a été procédé est une méthode qui consiste à avoir une idée sur la composition chimique de l'extrait concerné.
Les tests chromatographiques ont pour principe la détection des différents produits
turées, les stérols et les caroténoïdes. selon leurs polarités vis-à-vis de la polarité du solvant.
• la phase d'éther de pétrole sépare les produits très très apolaires tels que les acides gras, les huiles sa
• La phase dichlorométhane sépare les produits apolaires comme les flavonoïdes aglycones, les terpènes…
oyennement polaires tels onines, les alcaloïdes bases, les huiles
épare les produits les plus polaires comprenant les ses et osides, les hétérosides, les acides aminés, les acides phénoliques et les
la stimulation de l’appétit et de la reprise u poids. Ils ont également un intérêt dans la résistance et la perméabilité capillaire ; , des antioxydants, des éreux (Bruneton, 1993).
• La phase d'acétate d'éthyle sépare les produits m que les monoglycosides, les sap
essentielles…
• La phase butanolique s o
tanins.
D’un autre côté, les flavonoïdes sont les produits actifs les plus étudiés en pharmacognosie. Ils sont responsables de
d
ce sont également des inhibiteurs enzymatiques cardioprotecteurs et des anticanc
Le but est de confirmer la présence des flavonoïdes et de les séparer si possible.Pour cela, on a utilisé deux techniques chromatographiques (chromatographie sur papier (CP), chromatographie sur couche mince (CCM).
(Photo. 6. Les chromogrammes).
Photo. 6. Les chromogrammes.
2.2.1. Chromatographie sur papier (CP)
La chromatographie de papier est une méthode de séparation utilisée avec certaines mme les flavonoïdes. Elle utilise du papier de haute pureté et il existe sur le marché plusieurs marques ; parmi elles, le papier Whatman 3MM® qui a une grande absorbance. On peut l’utiliser aussi bien en mode descendant qu’ascendant.
2.2.1.1. Matériels et méthodes familles co
2.2.1.1.1. Matériels - Extraits
Ce sont les extraits de la petite centaurée: 1- Extrait éther-pétrole.
2- Extrait dichloro-méthane. 3- Extrait acétate d'éthyle. 4- Extrait 1-butanol.
- Matériel de laboratoire utilisé - Papier
Plaques commerciales 20x20 gel de silice 60F254
verre (20x20c et gel de silice (60GF254) (Merck).
utilisés
Ethanol (CH3CH2OH)( Pureté 96%) Fluca.
Dichlorométhane (éthylène chloride)(Pureté99%)
f Stinnes Chemicals Deusland).
17) (Pureté 99%) Fluca. %)(Riedel de Haën)l. (H2SO4)( Pureté 96%) Panrea. Whatman 3MM®. - - Plaques de - Cuves de chromatographie. - Baguettes de verre.
- Chambre noire (Viller Lourmat) à lampe ultra-violette visible (365-254nm) (VL-6-LC).
- Solvants et produits - Eau distillée (H2O).
- Méthanol (CH3OH)( Pureté 99,5%)(Jansen) -
-
- Acétate d'éthyle (Product o - Heptane (C7-H
- Ether diéthylique (CH3CH2) 2O. - Acide chlorydrique (H 3 O+ + Cl-).
- Acide acétique 15% (CH3COOH)(Pureté 99-100 - Acide sulfurique
- Anhydride acétique.
- Magnésium (Mg) (Pureté 97%)Merck.
- Chloroforme (CHCL3) ( Pureté ≥99%)(Fluca). - Chlorure ferrique (Fe CL3)( Panrea).
lué en méthanol) sont déposés
és.
ans une cuve chromatographique pour papier qui contient l’éluant acide acétique de l’eau15 :85v/v), on introduit le papier en le fixant
é sur une corde dans une hotte jusqu’à ce qu’il soit 2.2.1.1.2. Méthode
Sur le papier, on trace à l'aide d'un crayon une ligne le long du papier et loin de 8cm à l’une des extrémités ; sur cette ligne, on trace des points de telle sorte que la distance entre eux soit d’environ 4cm. A chaque point et avec une pipette, les extraits (l’extrait 1-butanol et acétate d’éthyle déjà di
sous forme de points (cercles de moins de 1 cm de diamètre). Après chaque dépôt et à l’aide d’un séchoir, on fait sécher les trac
D
15% (solution d’acide acétique et à l’aide d’une baguette de verre.
Après le développement du chromatogramme en mode descendant qui durera environ 5 heures, le papier est fix
séché totalement. Dans une chambre noire et sous la lumière d’une lampe UV (photo n°7) et avec un crayon, on trace les différentes bandes en mentionnant leurs couleurs.
Photo. 7. Chambre noire à UV
ec l’acide acétique 15% nous ont montré : 2.2.1.2. Résultats et discussion
Les tests chromatographiques sur papier (Whatman) des extraits acétate et 1-butanol élué av
- L’absence des flavonoïdes sous forme aglycone dans les extraits dichlorométhane et acétate d’éthyle.
es flavonoïdes (glycosides) dans l’extrait 1-butanol par la présence ur violette et a un rapport frontal levé (Rf=0.8), l’autre jaune et a un rapport frontal (Rf=0.1).
Remarque
e rapport frontal (Rf) est la distance entre le dépôt de la substance et sa migration.
C'est donc la distance le mil e e dista le
dépôt et le front du s
On nomme la bande supérieure: la bande I - qui se divise elle-même en deux bandes I a et I b - et la bande inférieure est dite la bande II.
La bande I apparaît sous ultratviolet d'une couleur violette et la bande II apparaît d'une couleur jaune.
Les mesures des rapports frontaux (Rf) sont les suivantes : - ande I a= 3 5/42=0,82
- Rf de la bande I b =30/42=0,71 - Rf de la bande II= 2/42=0,04
A savoir que chaque bande correspond à un ou plusieurs oduits, on peut dire que e sont des flavonoïdes polyglycosylés, tandis ue les (ou le) produits de la bande jaune sont des flavonoïdes monoglycosylés
b-Med Database 2002 ; www.herbmed.org).
.2.2. Chromatographie sur couche mince (ou CCM) .2.2.1. Matériels et méthodes
n a utilisé cette technique chromatographique avec l’extrait éther de pétrole (extrait °1) et l’extrait dichlorométhane (extrait N°2), avec des plaques commerciales Silica el GF254 et des plaques préparées au laboratoire et utilisant du gel de silice GF254
talé sur des plaques de verre (20x20cm).
’extrait est dissous dans le dichlorométhane et à l'aide d'un capillaire, on fait des plaque (la quantité du dépôt dépend de l’extrait et de sa concentration), - La présence d
sous UV de deux bandes majoritaires, l’une de coule é
L
entre olvant.
ieu de la band t le dépôt /la nce entre
Rf de la b 4,
pr les (ou le) produits de la bande violett
q (Her 2 2 O N G é L dépôts sur la
ensuite la plaque est émergée dans une cuve à chromatographie sur couche mince qui contient l’éluant (le dichlorométhane) et qui doit être d'une étanchéité extrême empêchant ainsi l'évaporation du solvant à l'extérieur.
2.2.2.2. Résultats
Le test chromatographique sur couche mince de gel de silice pour les extraits éther de pétrole (plaques de verre) et dichlorométhane, dans l’éluant dichlorométhane/méthanol 9 :1(plaque d’aluminium), a donné une coloration orange pour certaines taches sur la plaque CCM indiquant la présence des alcaloïdes dans les 2 extraits (Photo.8.).
Photo.8. Chromogramme (CCM phase dichlorométhane et éther de pétrole)
Conclusion
Ce test avec le test chromatographique CCM de l’extrait dichlorométhane, dans le dichlorométhane comme éluant, nous ont montré la richesse de cet extrait en produits naturels mais sans aucune information sur leurs natures (sauf pour les alcaloïdes).