4.2 La dépendance à RecA pour la recombinaison dif/dif ne
4.2.1 Le test d’excision de cassette et vérification de la
Afin de tester l’activation de la recombaison XerCD entre deux sites dif situés au chromosome nous avons utilisé le test d’excision de cassettes préa- lablement publié [59]. Le site dif bactérien a été remplacé par une cassette ADN (1kb) contenant deux sites dif en orientation directe. L’un des deux sites se trouve à l’extérieur du gène lacZ d’E.coli et le second est cloné
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Para Plac
FtsK
xerC xerD
XerC XerD dif dif
lacZα lacZβ white/inactive blue/active Ec Vc + - + - recA0 10 20 30 % excision/generation *
Figure 4.3 – Dépendance à RecA lors d’essais d’excision de cas- sette en LB. Gauche : Schéma représentant le test d’excision de cassette contenant deux sites dif. Les gènes codant pour XerC et XerD en vert foncé et clair respectivement, sont sous contrôle du promoteur Para. Un promo-
teur Plac situé à la fin du gène xerD et en orientation inverse sert à limiter
la fuite du promoteur Paraen présence d’IPTG. L’hexamère de Ftsk est re-
présenté par des cercles noirs. Après recombinaison entre les deux sites dif en intramoléculaire lacZ est partiellement délété. Droite : Graphique re- présentant le pourcentage d’excision de cassette par générations chez E.coli (Ec), ou V.cholerae (Vc). + et - indiquent si la souche est délétée pour le gène recA ou non. * : significativement différent (t test avec p<0.0001).
en phase dans lacZ de manière à obtenir une β-galactosidase fonction- nelle (voir Figure 4.3 gauche). En absence de recombinaison et sur boites LB+Xgal, les bactéries dégradent le Xgal et les colonies apparaissent alors bleues. En cas de recombinaison entre les deux sites dif, le gène lacZ est partiellement délété, la β-galactosidase n’est plus produite et les colonies sont blanches même en présence de Xgal.
En accord avec ce qui a été publié précédemment [173, 61, 59], le pour- centage d’excision de cassettes chez un mutant ∆recA est inférieur à celui de la souche wt chez E.coli (voir Figure 4.3 droite). La recombinaison n’est pas affectée chez V. cholerae.
146 La dépendance à RecA pour la recombinaison dif/dif... entre les différentes souches créées et contenant des versions de XerCD de V. cholerae ou E. coli (voir Figure 4.4).
Ec Vc 0 20 40 recA dependence (%) 60 80 100 xerCD/dif ftsK EcEc VcEc VcVc VcVc EcVc EcEc
Figure 4.4 – Graphique représentant la dépendance de la recom- binaison Xer à RecA en fonction des Xer utilisées. Ec : E.coli, Vc : V.cholerae, ftsK : correspond plus exactement au domaine Cter de FtsK.
.
Nous pouvons remarquer que la recombinaison avec les XerCDV.ch. de-
vient dépendante de RecA une fois chez E. coli, et inversement les XerCDE.coli
deviennent indépendantes de RecA pour la recombinaison une fois chez V. cholerae. Afin de vérifier que la raison pour laquelle les XerCDV.ch. de-
viennent dépendantes de RecA n’est pas parce que la protéine FtsK de E. coli active moins bien les recombinases de V.cholerae, nous avons éga- lement testé des protéines FtsK hybrides. Pour ces versions hybrides, les domaines Cter des deux espèces ont été intervertis. Bien qu’une diminution soit observée en présence des XerCDV.ch. et avec FtsKCvib, l’activation de
la recombinaison reste toujours fortement dépendante de RecA chez E.coli. Ces résultats suggèrent donc que notre hypothèse de départ est fausse et que le fait que la recombinaison dif soit dépendante ou non de RecA, n’est pas le seul fait des recombinases Xer.
147 Suite à ces premiers résultats nous avons supposé que ces différences pouvaient résulter du fait que la protéine FtsK est plus souvent en contact avec les sites dif chez V. cholerae que chez E. coli. En effet ces deux bacté- ries possèdent des chorégraphies de ségrégation des chromosomes fils issus de la réplication, très différentes. Chez E. coli l’organisation du chromo- some dans la cellule est tranversale : avec l’ori et le Ter situés au milieu de la cellule. Après leur réplication, les domaines Ter des deux chromosomes fils sont ségrégés très rapidement et migrent vers ce qui sera le milieu de la future cellule fille (pour revue sur la ségrégation des chromosomes bac- tériens voir Possoz et al. 2012 [175] ). Chez V. cholerae l’organisation du chromosome dans la cellule est longitudinale. Les Ter des deux chromo- somes fils restent plus longtemps ensembles et au niveau du septum de division avant de migrer aux trois quarts de la future cellule fille [176].
Les essais de recombinaison de cassettes chez E. coli et V. cholerae ont été réalisés en milieu riche LB. Dans un tel milieu, la vitesse de croissance cellulaire est plus importante et E.coli initie plusieurs cycles de réplications ce qui n’est pas le cas de V. cholerae. Nous avons donc comparé l’excision de la cassette difE.coli/difE.coli chez E.coli en milieu riche LB (croissance
rapide) et en milieu pauvre (M9) ; milieu où la vitesse de croissance de la bactérie devrait être moins rapide (voir Figure 4.5).
On remarque dans un premier temps que le pourcentage d’excision de cassettes chez E.coli est augmentée en milieu minimum. Cela suggère que lors d’une croissance ralentie (par rapport au milieu riche), les Ter restent plus longtemps au septum de division car sont ségrégés moins vite. En accord avec l’hypothèse émise ; la dépendance à RecA de la recombinaison Xer est significativement réduite. Pris ensembles ces résultats suggèrent que la dépendance à RecA de la recombinaison Xer est liée à la vitesse de
148 La dépendance à RecA pour la recombinaison dif/dif... recA dependence (%) % excision/generation 0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 25
Rich Minimal Rich Minimal
*
Figure 4.5 – textbfReprésentation graphique de l’excision de cassette dif/dif en milieu riche versus milieu minimum chez E.coli . Gauche : Gra- phique représentant le pourcentage d’excision de cassette par génération chez E.coli en milieu minimum (M9) ou milieu riche (LB). Droite : Gra- phique représentant la dépendance à RecA pour l’excision de la cassette difE.coli/difE.coli par recombinaison avec les E.coli Xer. * : significativement
différent (t test avec p= 0.0016)
croissance de la cellule et de ségrégation des domaines Ter. FtsK étant un protéine ancrée au septum de division, plus les Ter quittent rapidement le septum de division, moins FtsK peut rencontrer les synapses dif /Xer pour les activer.