Test de toxicité anormale

Le test d’innocuité est mené pour évaluer la possibilité que des substances aient des effets nocifs pour la santé d'organismes vivants. Le poids a été pesé par une balance de type (Sartorius BP 3100 S, 2015) d’une précision de 0,01 g. Après observation de souris blanche pendant 7 jours, il ressort ce qui suit (Tableau 7 et 8) :

Tableau 7 : Observation de l’état des souris expérimentale durant la durée du test.

J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 Souris TR O O O O O O O Souris QR O O O O O O O Souris TB O O O O O O O Souris QB O O O O O O O Souris TG-QB O O O O O O O

(O) : Bonne santé.

Tableau 8 : Observation du changement de poids des souris expérimentales durant la durée de test.

Trois premiers jours Trois derniers jours Pesée finale

TR (g) 22,22 23,72 24,19 QR(g) 23,08 24,58 25,02 TB(g) 22,53 24,03 24,33 QB(g) 21,41 22,91 23,31 TR-QB(g) 20,59 21,89 22,39 Témoin(g) 22,01 23,51 23,97

Résultats et discussions Chapitre V

Les deux tableaux ci-dessus montrent que les souris sont en bonne santé et survivent à l'issue de la période d'observation avec un gain progressif de leurs poids. Ce qui mène à dire que le sérum antidiphtérique est conforme et totalement stérile.

D’après Thraenhart en 1989, l’innocuité de tout produits immunologique à usage

humain est vérifiée par l’injection de cobayes ou aux animaux cibles. Si 70 % des animaux inoculés survivent, le test est jugé suffisant et satisfaisant (absence de toute toxicité anormale). En cas inverse le test a échoué (Thraenhart, 1989).

D’après Blanco en 1989, un produit est dit totalement stérile, celui qui n’a présenté aucun signe clinique, ni réaction locale et ni de lésion macroscopique observée chez les animaux autopsiés (Blanco et al., 1989).

Néanmoins, la communauté scientifique cherche activement à réduire le recours à l’expérimentation animale suite à la directive européenne 2010/63/EU.

Discussion générale

Le contrôle analytique effectué sur les immunosérums par les laboratoires de contrôle qualité agrées par l’autorité nationale de contrôle, se base sur les critères et les exigences de l’OMS, la commission de la pharmacopée Européenne et ainsi aux normes ISO (international organisation for standardisation).

L’autorité Nationale de contrôle suit le protocole approuvé dans le dossier d’autorisation de mise sur me marché AMM, dont la description des techniques analytiques, biologique et microbiologique s’effectuera pour chaque lot transmis par l’importateur ou le fabricant.

La totalité des tests se basent sur des méthodes et techniques décrite par la pharmacopée. Pourtant il y’a eu beaucoup de changements sur certain test effectué sur les immunosérums à usage humain, tel la suppression de l’essai de toxicité anormale par la pharmacopée en janvier

2019. Cette lois est venu pour rendre possible l’application du principe des 3R (Replacement, Reduction, Refinement) en référence à la substitution, la réduction et l’amélioration de l’utilisation des animaux à des fins expérimentaux (Fenwick et al., 2009).

L’objectif de notre étude était de déterminer la qualité des produits immunologique à usage humain notamment l’immunosérum antidiphtérique.

Résultats et discussions Chapitre V

64

En effet certains tests donnent un bon rendement en critères de jugements sur la qualité tel le test d’innocuité, de stérilité et même sur le dosage de certains constituant (protéines, préservateur). Les résultats trouvés en pratique correspondent aux normes exigées.

Mais cela reste insuffisants pour déterminé la qualité totale, la nécessité de poursuivre les restant des tests se fait ressentir. Le sérum antidiphtérique est constitué de plusieurs composés dont leur identité doit être vérifiée, tel que la concentration des solutés dissoute dans les sérums et le test d’apparence.

Outre, « Les méthodes rapides existent depuis une trentaine d'années, mais peinent toujours à s'imposer en test de routine » annonce ERIC Petat dirigeant d'ACM Pharma (Lien 12). Les méthodes de la biologique traditionnelle prennent un temps pour que les résultats apparaissent ; mais avec des méthodes plus rapide, le contrôle des immunosérum peut s’effectuée en un temps plus réduit.

Cependant, il est possible de faire appel à différents méthodes rapides pour effectuer les différents essais et tests exigées pour de contrôle de qualité, dont les résultats peuvent être donnés en temps réel.

Par l'introduction de la technique de « Titrage de Ramon » déjà expliqué dans la partie bibliographique et d’une technique de « Dodécylsulfate de sodium-électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) ».

Le « SDS-PAGE » est une méthode très utilisée pour contrôler la pureté, l’homogénéité des lots et la stabilité d’une protéine thérapeutique et également pour surveiller la cohérence de la fabrication depuis la taille des protéines et donc la pureté des protéines (Rodat, 2009).

Son principe se base sur la présence du sodium dodecyl sulfate (SDS) et d’un agent réducteur (2-mercaptoéthanol), qui engendrent la dénaturation de la structure quaternaire et la structure tridimensionnelle native des protéines, les protéines n’ont plus de ponts disulfures et ainsi la charge intrinsèque de la protéine est masquée. Il en résulte un complexe SDS protéine avec une charge constante. Donc la mobilité électrophorétique du complexe est proportionnelle au poids moléculaire de la protéine. En fin la visualisation des protéines peut se faire par différentes méthodes de détection par exemple ; coloration par bleu de Coomassie ou des argent plus sensibles. Le poids d'une protéine donnée peut donc être estimé à partir d'une série d'étalons de protéines (Salas et al., 2006).

Résultats et discussions Chapitre V

La première technique permettra de faire un test d’identité plus rapide (à la place de la technique Ouchterlony), tandis que la seconde, un test pureté. Le titrage donnera la quantité des anticorps trouvés dans la solution et l’électrophorèse déterminera l’identité soit la pureté, présence d’anticorps monoclonaux dans le sérum thérapeutique (selon leurs migrations sur le gel et selon leur poids moléculaire). Ce qui réduira le temps du contrôle des immunosérums pour être libéré du laboratoire d’une part et d’une autre part ces techniques sont moins couteuses et facile à effectuer. Et pas que, les résultats de ces tests pouvant déterminer l’innocuité de ces produits injectables et donc évincer le test de la toxicité anormale.

Les tests de stérilité prennent également du temps, ce qui cause un inconvénient pour libérer plus rapidement les sérums thérapeutiques. Sur ce fait, il existe effectivement plusieurs méthodes microbiologiques.

Parmi elles, l’impédancemétrie, qui est une technique analytique qui permet une détection des microorganismes avec sensibilité (Felice et al., 1999). Elle est considérée comme une méthode alternative rapide dans le domaine de l’industrie agroalimentaire ou pharma- cosmétique, et vise à détecter et quantifier les bactéries d’un produit, dans le cadre par exemple d’un test de stérilité secteurs (Rule, 1997).

Son principe consiste a utilisé une gamme de plusieurs milieux de cultures permettant de cibler les différents types de microorganismes recherchés au laboratoire. Les protéines et les sucres trouvé dans le milieu de culture sont électriquement neutres et faiblement ionisés. Les micro-organismes transforment ces molécules et libèrent des molécules plus petites, tels que des acides aminés ou du lactate par exemple, qui possèdent une charge et une mobilité électrique nettement supérieures aux molécules d’origine. Ces modifications peuvent être mesurées grâce à un couple d’électrodes immergées dans le milieu de croissance. La sensibilité des appareils permet de mesurer en temps réel la croissance bactérienne par une mesure électrique des variations très faibles d’impédance (la résistance du milieu à un courant électrique entre deux électrodes), et donc de détecter des quantités très faibles de bactéries longtemps avant que des colonies ne soit visibles sur boîtes de Pétri. Le principal intérêt de ces techniques est de produire des résultats significativement plus rapidement (habituellement en 2 à 24 heures) (Rouillard, 2004).

Il serait donc intéressant, pour compléter ce travail, de réaliser des études plus approfondies sur ces méthodes pour contribuer à l’amélioration du contrôle de la qualité et de la sécurité.

Conclusion

Certes la diphtérie a été éradiqué dans plusieurs pays dans le monde, mais reste présente dans d’autre, notamment ceux en voie de développement ou ceux du tiers monde où les conditions sanitaires sont médiocres. Cette maladie reste une urgence médicale, l’acquisition des traitements curatifs « sérum thérapeutique » et préventifs « vaccins » est donc obligatoire.

Bien que la qualité, l’innocuité et l’efficacité d’un médicament relève de la responsabilité du fabricant, c’est surtout l’autorité nationale de contrôle, qui établit indépendamment les procédures destinées à garantir la conformité des produits aux normes exigées.

Le contrôle, sorte de filtre destiné à piéger les produits non conforme qui ne satisfont pas une exigence spécifiée, est donc une obligation, qui s’effectuera par des inspections biochimiques et microbiologique régulière.

Ce qu’il faut retenir à partir de notre étude réalisée dans le laboratoire de contrôle de qualité des vaccins et des sérums à usage humain à l’Institut Pasteur d’Alger (IPA) sur l’antisérum diphtérique « Antitoxine diphtérique B.P » importé de l’Inde. Ce dernier est en conformité avec les exigences nationale soit : une concertation en protéine totale de 11,26 ± 0,14 mg/ml, Un pH de 6,5 ± 0,01, un volume extractible de 10 ml présent dans le flacon, une concentration de préservateur Crésol de 0,15%, un test d’identité positive, et ainsi qu’une absence totale de germes. En fin un test de toxicité négative prouvant l’innocuité du produit.

Ces donnés sont certes en adéquation avec les normes et les méthodes recommandés par les normes de la pharmacopée en vigueur. Mais un complément de recherche est recommandé pour déterminer la conformité totale du produit car malheureusement l’expérimentation y afférente n’a pu être mené à terme, affecté négativement par la pandémie mondiale Covid-19 avec dispositif sanitaire d’un confinement stricte décidé par le pouvoir public qui à interrompu nos travaux au niveau du laboratoire de contrôle qualité a l’institut pasteur.

Cependant ce travail ouvre différentes perspectives dans le domaine du contrôle des médicaments à fins thérapeutiques.

D’une part, au regard de la fiabilité des méthodes, il apparaît naturel de poursuivre le cycle de vie des méthodes, par l’évaluation périodique, la maintenance et la maîtrise des changements.

Conclusion

67

D’autre part, il est possible alors d’envisager une toute autre approche, par l’introduction de nouvelles techniques plus rapides pour effectivement libéré les lots, en l’occurrence celles discuté dans la partie discussion.

En conclusion, les progrès de la biotechnologie ont été extrêmement remarquables ces dernières années dans les fabrications des médicaments à partir des organismes vivants. Mais le contrôle de qualité en biotechnologie ne s’arrête pas à la fabrication, un suivie de cette dernière est obligatoire.

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