6.3.1.2 Test antifongique en milieu liquide

L’activité antifongique in vitro des extraits de violettes a tout d'abord été évaluée par essais microspectrophotométriques avec des plaques ELISA stériles à fond plat transparent. Pour cela les spores de la souche à tester collectées dans 10 ml d’eau stérile sont dénombrées sur cellules de Fuchs- Rosenthal en microscopie afin de déterminer leur concentration. On réalise ensuite 10 ml de suspension de spores à environ 5000 spores/ml dans du PDB à 5,3 g/L pour toutes les souches sauf Phytophthora capsici pour laquelle on utilise du milieu V8. Chaque puit de la plaque est ensuite rempli avec 90 µl de cette suspension à laquelle sont ajoutés 10 µl d’extrait à tester, pour un volume final de 100 µl par puit. Ainsi, une dilution au 10ème _{de l’extrait à 10 mg/mL est analysée. Un témoin négatif est intégré à chaque}

plaque en ajoutant 10 µL d’eau stérile. Plusieurs mesures de DO à 595 nm sont ensuite relevées à l’aide d’un lecteur de plaque au temps initial (T0), puis 3 jours (T3) et 5 jours (T5) après. Entre temps les plaques sont placées à 22 °C dans l’obscurité. Chaque extrait est analysé en triplicata et une CI50 est

calculée afin de mettre en évidence les violettes présentant des activités pertinentes. Un premier criblage de la collection a été réalisé sur les souches Botrytis cinerea, Colletotrichum higginsianum et Fusarium

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graminearum. Les violettes ayant présenté une activité d’intérêt ont ensuite été analysées sur Alternaria brassicicola et Phytophthora capsici.

IV.6.3.2 Activité de défense des plantes

Le gène PR1 (pour Pathogenesis related 1) est un bon marqueur des réponses de défense chez les plantes car il est induit par de nombreux stress comme l’acide salicylique, l’éthylène ou encore toutes attaques de microorganismes phytopathogènes (Ohashi et Ohshima, 1992). Pour savoir si la plante répond à un stress, des plantes modifiées sont utilisées : elles expriment la région régulatrice de ce gène, appelé le promoteur, couplé à un gène marqueur, le gène GUS responsable de la synthèse de la β- glucuronidase qui va réagir avec son substrat le X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Glucuronic acid) pour conduire à la formation d’un précipité bleu (Figure 140). L'activité Gus est donc détectée par accumulation du produit de réaction bleu lors de l'hydrolyse du substrat X-Gluc par la β-Glucuronidase lors de la transcription du gène PR1. Arabidopsis thaliana est généralement la plante utilisée car elle est facile à transformer de façon stable, sa croissance est rapide et elle est suffisamment petite pour entrer dans des plaques 48 puits, adaptée aux analyses haut débit.

Figure 140. Clivage du X-Gluc par la β-glucuronidase conduisant à la production du chloro-bromoindigo se dimérisant en dichloro-dibromoindigo de couleur bleu

Les graines d'Arabidopsis thaliana sont trempées pendant 10 minutes dans une solution de stérilisation contenant 1 volume d'hypochlorite de sodium (NaClO) à 2,6 %, 5 volumes d’éthanol 100 % et quelques gouttes de triton. Deux lavages rapides à l’éthanol 95 % suivent avant séchage quelques heures sous PSM, jusqu’à ne plus observer d’agglomération des graines. Après cette stérilisation en surface, les graines sont transférées, à l’aide d’une pointe de cône préalablement stérilisée au bec bunsen, dans des puits de plaques 48 puits, contenant 500 µl de milieu MS (Murashige et Skoog, Sigma-Aldrich) supplémentés avec 1% de saccharose. Les plaques sont incubées à 23 °C avec une période d'illumination de 16 h le jour et de 8 h la nuit sous agitation rotative de 90 tr/min pendant environ 5 jours. Un tri est ensuite opéré afin de conserver une seule plantule par puit et les plaques sont de nouveau incubées, cette fois-ci sur un plateau statique pendant environ 4 jours. Le milieu MS additionné de 1% de saccharose est ensuite remplacé par 500 µl de milieu MS sans saccharose, qui pourrait perturber la coloration et induire des erreurs de lecture. Après 48 heures d'incubation, le milieu MS est renouvelé (450 µl) et 50 µl d’extrait de violette sont ajoutés. Chaque extrait est analysé en triplicata avec intégration d’un témoin positif, une solution de Bion à 40 µg/ml, d’un blanc H2O et d’un blanc MeOH à 50% pour valider les

résultats.

Après deux jours de mise en contact, le milieu est retiré et 500 µl de solution de coloration GUS, composée de 483,9 µl de Tampon phosphate pH 7, 4,03 µl de solution FerriC K et de solution de FerroC K à 0,1 M et 8,06 µl de substrat X-Gluc à 50 mg/ml dans du NN-diméthylformamide, sont ajoutés dans chaque puit. On applique deux fois 30 minutes de vide sur les plaques non couvertes et on incube à 37 °C pendant minimum 2h, jusqu’à ce que les témoins positifs soient colorés en bleu. Une fois la coloration réalisée, la solution est retirée et les feuilles décolorées en ajoutant dans les puits de l’éthanol à 70% afin de visualiser les spots bleus sur les plantules.

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