Techniques sérologiques utilisées

4.3.1. L’immunofluorescence indirecte (IFI) :

Tous les sérums ont été testés par immunofluorescence indirecte selon les procédures d’analyses concernant les techniques de sérologie quantitative du groupe Rickettsia du « Guide De Bonne Exécution des Analyses de biologie édicale » (GBEA) [192]:

Après décongélation et mise à température ambiante et dilution au ½ dans du PBS (phosphate- buffered saline) stérile, les antigènes sont déposés sur une lame de verre (dégraissée dans l’alcool méthylique pendant 2 heures minimum) avec une plume différente pour chaque antigène.

Les antigènes sont toujours déposés dans la même position de haut en bas. Les lames sont ensuite fixées pendant 10 mn dans l’acétone.

Les sérums à analyser sont décomplémentés pendant 30 mn à 56° C puis dilués en cascade dans le PBS lait jusqu’à 2048 pour les immunoglobulines G (IgG ) et 1024 pour les immunoglobulines M (IgM).

Une fois la lame sèche, les sérums qui ont été dilués en cascade sont déposés sur les antigènes ; si pas de reprise d’un sérum antérieur du malade, une lame est utilisée par malade ; la première rangée sert aux IgG, la deuxième aux IgM. Si reprise d’un sérum antérieur du malade, deux lames sont utilisées par malade (une pour les IgG, une pour les IgM) ; la première rangée servira au sérum antérieur et la deuxième pour le sérum du jour. Un témoin positif, constitué par un sérum positif connu titré en IgG et IgM, est pris pour chaque lame.

La lame est ensuite rincée deux fois (10 mn chacune) dans une solution de tampon phosphaté (PSB) additionné de 2 % de Tween et une fois dans de l’eau distillée (pendant 5 mn), puis séchée à l’étuve.

Les globulines fluorescentes sont ensuite déposées sur la lame qui est de nouveau incubée à 37° C pendant 30 mn en atmosphère humide.

Après rinçage, comme dans l’étape précédente, la lame est montée avec une lamelle en appliquant du fluorep, l’observation au microscope à fluorescence peut commencer.

Le résultat quantitatif est donné par la dernière dilution de sérum pour laquelle on observe une fluorescence du micro-organisme.

L’interprétation des résultats sérologiques peut être gênée par les réactions croisées qui existent entre les membres du groupe boutonneux pourpré:“ spotted fever group ” (SFG) et entre les membres du SFG et du groupe typhus: “ typhus group ” (TG).

a- Les exanthèmes fébriles :

Tous les sérums des malades présentant une éruption fébrile ont été testés vis-à-vis des antigènes de R. prowazekii et de 7 rickettsies appartenant au groupe boutonneux pourpré: R. conorii conorii, R. felis, R. africae, R. aeschlimannii, R. massiliae,

R. sibirica mongolitimonae, R. conorii israelensis.

Certains sérums ont été testés en plus vis-à-vis d’autres rickettsies du SFG il s’agit de : R. slovaca, R. helvetica, R. akari et vis à vis de l'autre membre du groupe typhus: R. typhi.

Seuils de positivité :

Actuellement à l’Unité des Rickettsies de Marseille, les seuils de positivité retenus sont [97]:

- Pour la fièvre boutonneuse méditerranéenne (FBM): un titre d’IgG ≥ 1/128 et/ou un

titre d’IgM ≥ 1/ 64

b- Les autres populations:

¾ Chaque malade a bénéficié d’un prélèvement de sérum qui a été analysé en IFI vis-à-vis des antigènes de R. prowazekii et ont été considérés comme positifs les sérums avec des titres d’anticorps de type IgG ≥ 1/64 [194].

¾ D’autre part les sérums de ces populations ont été analysés également par IFI vis-à-vis des antigènes de deux autres pathogènes transmis par les poux de corps :

- Bartonella quintana : titre d’IgG ≥ 1/100 (seuil retenu pour la fièvre des tranchées) [53,81,186].

- Borrelia recurrentis : seuil de positivité, titres d’IgG ≥ 1/128 [166].

4.3.2. L’adsorption croisée [80]:

On utilise en général 2 antigènes parfois plus si nécessaires. L’un des 2 antigènes (A) correspond à l’étiologie la plus vraisemblable dans la zone géographique concernée compte tenu du tableau clinique. L’adsorption croisée doit être réservée aux sérums

ayant des titres d’anticorps > 1/64.

L’adsorption croisée consiste à tester 3 échantillons du sérum avant manipulation, puis après avoir fait réagir le sérum avec l’antigène A, ou l’antigène B.

Le sérum adsorbé est ensuite testé en immunofluorescence indirecte et Western blot contre les antigènes A et B.

Le sérum non adsorbé montre des anticorps contre A et B. Le sérum adsorbé ne doit plus présenter de réaction contre l’antigène avec lequel il a été adsorbé.

En revanche, si l’adsorption avec l’un des 2 antigènes enlève à la fois les anticorps contre les antigènes homologues et hétérologues (ex : après adsorption par A, il ne reste d’anticorps ni contre A ni contre B, alors que l’adsorption par B laisse des anticorps

contre A) on peut affirmer avec certitude qu’il existe une réaction spécifique contre l’antigène A.

4.3.3. Le Western blot [80,93]:

Des isolats d’antigènes de rickettsies sont mis en suspension dans de l’eau distillée et ajustés à une concentration de 2 mg de protéines /ml. 20 microlitres de la préparation obtenue sont ensuite mis en électrophorèse à 100 V pendant 2 heures à travers un gel séparateur contenant 12 % de polyacramide grâce à un appareil Mini-Protean II cell (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France).

Un mélange de masse moléculaire standard (Kaleidoscope ; Bio-Rad) est utilisé pour estimer la masse moléculaire des antigènes séparés. Les antigènes obtenus sont transférés sur des pores de membrane de nitrocellulose de 0,45 µm de diamètre (Bio-Rad) puis mis en électrophorèse à 100V pendant 1 heure à 4 °C. Les blots ainsi obtenus sont gardés, avec 5 % de poudre de lait écrémé, toute la nuit à 4 °C dans du Tris-buffered saline (TBS) puis lavés à l’eau distillée. Les échantillons de sérums, dilués à 1:200 dans du TBS avec 3 % de poudre de lait écrémé, sont appliqués sur les blots pendant 1 heure à température ambiante. Après 3 lavages, de 10 mn chacun, dans du TBS avec 3 % de poudre de lait écrémé, les blots sont incubés pendant une heure avec des anticorps de chèvre de type IgG conjugués à la peroxydase (Southern Biotechnology Associate, Birmingham, Al, USA) et dilués à 1:750 dans du TBS avec 3 % de poudre de lait écrémé. Les blots sont lavés 3 fois dans du TBS et les bandes conjuguées sont lues après incubation de 15 minutes dans une solution composée de 0,015 % de 4 chloro-1-naphtol (Sigma, Lyon, France) et 0,015 % de peroxyde d’hydrogène dans du TBS avec16,7 % de méthanol.

Le Western blot peut être réalisé avant ou après adsorption croisée.