Techniques protéomiques Prélèvement du venin.

Réglementation et conditions de détention des serpents.

La convention de Washington (convention sur le commerce international d’espèces de faune et flore sauvage menacées d’extinction, ou CITES), signée en 1973 classe les espèces en trois annexes. La capture, le transport, la détention, la cession et la destruction des animaux inscrits dans une de ces annexes sont réglementés.

- L’annexe I : espèces menacées d’extinction dont le commerce est interdit, des autorisations au cas par cas peuvent être données pour des nécessités de recherche dûment justifiée.

- L’annexe II : espèces protégées dont le commerce est autorisé sous réserve d’accords particuliers délivrés avant le transport par une autorité habilité.

- L’annexe III : espèces protégées dans leur pays d’origine, même disposition que l’annexe II.

Il n’existe pas de définition claire des animaux dangereux au regard des textes français. L’arrêté du 21 novembre 1997 les définit comme des animaux qui « présentent des dangers ou inconvénients graves ». Ils sont le plus souvent, assimilés aux animaux non domestiques et révèlent du cadre réglementaire correspondant.

Le certificat de capacité reconnait à son propriétaire la compétence nécessaire pour l’entretien d’animaux non domestiques. Il est délivré par la direction des services vétérinaires. Un registre précisant l’origine des animaux et leur mouvement doit être tenu à jour.

Les installations doivent assurer la sécurité du personnel et visiteurs ainsi que la protection des animaux détenus. Il existe un devoir de protection et de bons traitements concernant la nourriture, les soins l’hébergement (cage adaptée à l’espèce) et la manipulation (excluant les instruments offensifs) [52] [3].

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Prélèvement, purification et conservation du venin de serpent.

Les herpétologues sortent les serpents de leur cage à l’aide d’un crochet. Ils les déposent au sol où ils les immobilisent, en les maintenant derrière la tête. Certaines manipulations se font à mains nues pour un meilleur ressenti des

mouvements et réactions de l’animal. Le venin s’obtient par pression manuelle (massage de la glande à venin ou morsure d’un verre surmonté d’un film plastique) ou stimulation électrique des glandes salivaires de serpents [52].

S’il n’est pas directement utilisé, le venin brut ou « natif » ainsi obtenu est desséché sous vide ou lyophilisé. Il peut être conservé en ampoule scellée à basse température plusieurs dizaines d’années, cependant quel que soit le procédé de conservation certaines activités enzymatiques semblent toutefois s’altérer avec le temps. Plusieurs banques de venin se sont ainsi constituées et enrichies au fils des années dans les instituts de recherche [85] [3].

Séparation des différents constituants.

Après avoir prélevé et purifié le venin, il faut séparer les différents constituants qui le composent afin de procéder à des analyses plus poussées en laboratoires. Il existe plusieurs techniques qui séparent les composants en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques ou de leur affinité pour un liguant. On peut citer l’électrophorèse et la chromatographie.

L’électrophorèse.

L'électrophorèse (simple) est une technique permettant de déplacer des ions sous l'effet d'un champ électrique. Ceux-ci vont migrer vers leur électrode respective : les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (potentiel positif) et les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (potentiel négatif). Les molécules non chargées ne migrent pas. Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l'électrophorèse, la vitesse de migration et la distance parcourue dans la matrice par ces ions différent, ce qui permet de les séparer.

Figure 57 : Prélèvement de venin.

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L’électrophorèse de référence pour la protéomique est l’électrophorèse bidimensionnelle. La première dimension consiste en une isoélectrofocalisation (IEF). Les polypeptides migrent jusqu’à un pH égal à leur point isoélectrique « PI », c’est-à-dire jusqu’à ce que leur charge nette soit nulle. La deuxième dimension sépare les protéines selon leur différente masse molaire sur un gel d’électrophorèse de polyacrylamide en conditions dénaturantes.

Ces deux électrophorèses sont effectuées de manière perpendiculaire l’une par rapport à l’autre. Comme les paramètres de la séparation sont indépendants, cette technique est particulièrement résolutive, ainsi plusieurs centaines de chaines polypeptidiques peuvent être séparées sous forme de taches de protéines appelées « spot » sur un gel. Les protéines sont révélées par coloration. Les logiciels d’analyse d’image des gels repèrent les spots et calculent leurs coordonnées et leur intensité.

La chromatographie.

La chromatographie est une méthode séparative qui permet l’identification et le dosage des différents composés d’un mélange.

Le venin brut est injecté dans un chromatographe qui va séparer les différents constituants en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques. Cette opération sera répétée le nombre de fois nécessaire afin d’obtenir la molécule d’intérêt avec la pureté désirée [86].

Il existe 3 grandes familles de chromatographie :

- CPG (GC) : Chromatographie en Phase Gazeuse.

- CPL (LC) et HPLC : Chromatographie Liquide ou Chromatographie Liquide Haute Performance. L’uHPLC nouvellement développée fournit une nouvelle alternative.

- CCM : Chromatographie sur Couche Mince.

La chromatographie liquide haute performance (CLHP) est le plus souvent exécutée en utilisant la phase inverse ou « phase reverse » (RP) dans la protéomique pour séparer les différents composés de venin [84].

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L’échantillon de venin dissous par une phase mobile ou « éluant » est entrainé à travers une phase stationnaire. Le principe est basé sur les différences d’affinités des composés du

mélange avec la phase stationnaire et la phase mobile. La phase stationnaire fixe, retient plus

ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire.

Le chromatogramme traduit la variation du soluté dans l’éluant (phase mobile) en fonction du temps. Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire. La maîtrise de toutes les conditions de séparation permet la reproductibilité parfaite du temps de migration d'un composé donné.

Souvent, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues ou par comparaison avec les résultats de l'analyse d'une solution étalon. Ces substances servent de références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par comparaison des vitesses de séparation et éventuellement d'autres renseignements donnés par la détection. Il s'agit de

chromatographie analytique. Dans d'autres cas, on se contente de séparer les fractions pour

les identifier par d'autres techniques : c'est la chromatographie préparative. Le

chromatographe peut être couplé à un spectromètre de masse pour l'identification de composés inconnus.

Figure 58 : Chromatographie RP-HPLC du venin de mamba vert (Dendroapsis angusticeps) révélant plus de 150 composés différents.

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Spectrométrie de masse et caractérisation de la structure primaire (Analyse structurale).

Il existe une très grande diversité moléculaire propre à chaque venin. Une fois que la toxine a été isolée on caractérise sa structure. La spectrométrie de masse donne accès à l’empreinte moléculaire du venin. Il s’agit d’une technique analytique très puissante et très sensible permettant d'analyser les composés organiques. Elle permet à la fois de déterminer la masse moléculaire et de remonter à la séquence en acide aminé du composé analysé mais aussi de corréler le spectre d'un composé avec sa structure. La caractérisation de la structure est primordiale car la structure qui constitue la carte d’identité de la molécule donne également des indications sur le récepteur qui sera ciblé [86].

Une avancée technologique.

La spectrométrie de masse, en tant que technique d’analyse, a effectué un bond prodigieux depuis une vingtaine d’année. La mise au point de nouvelles sources d’ionisation, permet

aujourd’hui d’entrer dans la protéomique et d’analyser des échantillons de tout type : des

petites molécules organiques apolaires et volatiles aux macromolécules biologiques polaires et peu volatiles telles que les peptides et protéines qui sont les constituants principaux des venins ophidiens) et sous diverses formes (solide, liquide ou gazeuse). La nécessité de volatiliser l'échantillon, par chauffage sous vide, avant de pouvoir l'ioniser, a longtemps cantonné la spectrométrie de masse à l'étude de composés volatils (ou volatilisables), excluant l’analyse de tous les composés de haut poids moléculaire et thermolabiles (tel que les peptides et protéines). Il a fallu attendre la fin des années 1980 et l’émergence de nouvelles techniques d’ionisation dites « douces » comme l’électrospray (ESI) et l’ionisation-désorption laser assistée par matrice (MALDI), pour que la spectrométrie de masse mette le pied dans le domaine de la biologie et l’analyse des venins. Aujourd'hui, la spectrométrie de masse est devenue un outil incontournable en analyse protéomique (identification de protéines, séquençage de peptides, caractérisation de modifications post-traductionnelles) et trouve des applications dans des domaines variés. Sa sensibilité et son couplage facile avec des méthodes de séparation (chromatographie gazeuse ou liquide) en font également une méthode de choix pour le contrôle qualité et le dosage de diverses molécules présentes à l'état de traces dans des mélanges complexes [87].

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Spectromètre de masse simple MS (principe).

La spectrométrie de masse est une technique physique d’analyse permettant de détecter et d’identifier les molécules d’intérêt par mesure de leur masse et de caractériser leur structure chimique. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse des molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (M/Z).

Le spectromètre de masse est composé de 5 parties :

Figure 59 : Composition du spectromètre de masse

Système d’introduction