R´ecemment, des ´etudes pouss´ees ont ´et´e r´ealis´ees sur la caract´erisation du lien entre les forces m´ecaniques g´en´er´ees par la cellule ou l’environnement et le main-tien des fonctions biologiques. Pour ce faire, des m´ethodes de mesure sur cellule unique `a des ´echelles spatiales et temporelles vari´ees, ont ´et´e mises au point comme la microaspiration (Oh et al., 2012; Stark et al., 2011), les pinces optiques (
Sim-mons et al., 1996; Guck et al., 2001; Neuman and Nagy, 2008; Li et al., 2002), la
microscopie `a force atomique AFM (A-Hassan et al., 1998; Mahaffy et al., 2000;
Fabry et al., 2001), les micropilliers (Legant et al., 2013; Fu et al., 2010), ainsi que des techniques passives utilisant le mouvement brownien de billes dans la cellule. Le tableau 1.4.2 et la Fig.1.19 r´esument les techniques disponibles pour sonder les propri´et´es m´ecaniques des cellules uniques. Les m´ethodes sont partag´ees entre des m´ethodes ”actives” et ”passives”. Les m´ethodes actives consistent `a appliquer une contrainte/d´eformation `a la cellule et de mesurer directement le module ´elastique. Cependant, pour passer de cette mesure au calcul du module visco´elastique, il faut faire des hypoth`eses suppl´ementaires g´eom´etriques. Quand aux m´ethodes passives, elles consistent `a d´etecter le mouvement al´eatoire de particules traceurs en r´eponse aux sollicitations du milieu sans force appliqu´ee.
Ces techniques contribuent `a notre compr´ehension des propri´et´es m´ecaniques des cellules et cytosquelette. Toutes ces techniques sont compl´ementaires avec leur propres avantages et d´esavantages. Cela est dˆu au fait que la cellule est un milieu complexe, o`u l’h´et´erog´en´eit´e, la plasticit´e, le remodelage actif et les m´ecanismes de signalisation sont tous dominants.
La mesure directe des propri´et´es m´ecaniques d’un mat´eriau demande une appli-cation de force pr´ecise et bien d´efinie ainsi qu’une mesure pr´ecise de la d´eformation r´esultante.
Les principaux outils de mesure de la m´ecanique cellulaire donne des informations sur la structure et la dynamique du cytosquelette, la rigidit´e locale de la cellule, le stockage et la dissipation de l’´energie m´ecanique et la r´egulation de la tension interne.
1.4.1.1 Les pinces optiques et magn´etiques Pinces optiques
Les pinces optiques utilisent un gradient de force qui agit sur des particules au centre d’un rayon laser focalis´e (Ashkin, 1992) (Fig.1.19a). En suivant le d´eplacement des v´esicules ou billes par rapport au pi`ege optique, il est possible de d´eduire la force appliqu´ee et le d´eplacement des billes dans le r´ef´erentiel des cellules, et donc d’avoir acc`es au modules ´elastique et visqueux.
Un d´esavantage de cette m´ethode concerne les forces impos´ees par pince optique qui ne sont pas suffisamment importantes (<200 pN) pour promouvoir des d´efor-mations significatives, nec´essaires pour simuler des situations in vivo de cellules
Figure 1.19 – R´esum´e des techniques exp´erimentales actives et passives les plus communes pour d´eterminer la m´ecanique cellulaire localement et la m´ethode passive.(a) Les m´ethodes mi-crorh´eologiques actives fournissent des propri´et´es locales du mat´eriau.(b) Les m´ethodes passives permettent de mesurer la microrh´eologie. (Ahmed et al.,2015)
canc´ereuses. De plus, l’exposition directe du faisceau `a la cellule pendant l’´etirement est un autre d´esavantage car cela endommage la cellule.
Magn´etocytom´etrie
Le principe des exp´eriences de magn´etocytom´etrie (MTC : Magnetic Twisting Cy-tometry) (Wang et al.,1993;Maksym et al.,2000; Fabry et al.,2001;Laurent et al.,
2003) est bas´e sur le couple exerc´e par un champ sur un dipˆole magn´etique.
Cette technique g´en`ere des forces appliqu´ees sur des billes ferromagn´etiques avec un ´electroaimant pour mesurer la r´eponse m´ecanique des cellules. Les billes peuvent ˆetre attach´ees `a la surface des cellules en utilisant des adh´esions sp´ecifiques. Le diam`etre des billes est d’environ 5➭m. Un gradient de champ magn´etique est impos´e `a la bille et le d´eplacement de cette derni`ere en r´eponse `a la force appliqu´ee peut ˆetre mesur´e avec une r´esolution spatiale sub-nanom´etrique (en dessous de la limite de la r´esolution optique du microscope) (Fig. 1.19). Les mesures effectu´ees `a l’aide de cette technique montrent que l’on reste dans un domaine de d´eformation lin´eaire pour la cellule `a grandes contraintes (1 `a 300 Pa) et grandes d´eformation (5 `a 500 nm de d´eplacement de la bille (Fabry et al., 2001). Les perturbations sinuso¨ıdales sont sur une gamme de fr´equences de 10−2 `a 103 Hz. Les avantages sont que la r´eponse de fluage `a une force peut ˆetre mesur´ee sur une longue dur´ee. Avec un champ homog`ene, il est possible de faire de bonnes moyennes en suivant simultan´ement plusieurs billes attach´ees aux cellules. Des billes sub-microm´etriques peuvent ˆetre aussi internalis´ees et attach´ees directement au cytosquelette.
ces deux techniques a ´et´e effectu´ee (Laurent et al., 2002) avec des billes de mˆeme diam`etres et les valeurs de E avec la MTC sont plus petites que celles obtenues avec des pinces optiques. Ceci refl`ete bien l’h´et´erog´en´eit´e des r´esultats en fonction de la m´ethode utilis´ee.
1.4.1.2 La microscopie `a force atomique
La microscopie `a force atomique permet la mesure locale de propri´et´es m´e-caniques. Un levier flexible est utilis´e pour indenter la cellule (Radmacher et al.,
1993; Radmacher, 2007). La d´eflection du levier est mesur´ee par un laser qui est
r´efl´echi `a la surface du levier et illumine les photodiodes comme d´ecrit dans la Fig.1.19a. Pour mesurer les propri´et´es m´ecaniques de la cellule, la pointe peut ˆetre sph´erique ou pyramidale, ce qui permet l’utilisation des mod`eles d’analyse de Hertz et Sneddon (Sneddon(1951)) qui d´ecrivent la force comme fonction de l’indentation en prenant en consid´eration les propri´et´es m´ecaniques du mat´eriau. Ces mod`eles sont plus complexes que ceux avec des particules intracellulaires puisque l’aire d’in-teraction augmente quand l’indentation du levier augmente.
Mahaffy et al. (2000) ont propos´e un protocole pour mesurer les propri´et´es
vis-col´eastiques par AFM. La gamme de forces applicables par cette technique va de la dizaine de pN `a quelques centaines de nN. Pour la mesure des propri´et´es visco´elas-tiques des cellules en r´egime sinuso¨ıdal, les forces appliqu´ees restent relativement faibles (typiquement de quelques centaines de pN `a du nN). Des mesures des mod-ules ´elastiques (G′
)et visqueux (G′′
) de cellules canc´ereuses ont ´et´e effectu´ees avec cette m´ethode (Alcaraz et al.,2003), et un marqueur du potentiel m´etastatique a pu ˆetre d´eduit (Rother et al.,2014). La dominance de l’actine dans la determination de la rigidit´e de la cellule est montr´ee dans une ´etude utilisant un microscope `a force atomique (AFM) pour quantifier la rigidit´e avec des indentations inf´erieures `a 200 nm de cellules endoth´eliales (Costa et al.,2006)
L’un des avantages de l’AFM est une grande gamme de forces accessibles, avec des microscopes commerciaux bien d´evelopp´es et une grande gamme de g´eom´etries de leviers. La difficult´e de ces mesures r´eside dans la prise en compte de certaines corrections, comme la force de train´ee ou la forme de la pointe (Rico et al.,2005)
Une description plus d´etaill´ee de cette m´ethode est faite dans le chapitre 2.
1.4.1.3 M´ethodes passives
Des m´ethodes passives sont aussi capables d’extraire des propri´et´es visco´elas-tiques en suivant le mouvement Brownien des organelles ou des microparticules dans la cellule (Levine and Lubensky,2000). La r´esolution est sub-nanom´etrique et d’environ la microseconde grˆace au laser opto´electronique. La gamme de fr´equences est environ de 0.1 `a 30000 rad.s−1. Les modules visco´elastiques de l’int´erieur de la cellule peuvent ˆetre obtenus `a partir du mouvement des particules. Le mouvement quadratique moyen des traceurs (Mean Squared Displacement MSD) est mesur´e.
Une fonction de corr´elation entre deux positions de particules contenues dans le milieu cellulaire permet de remonter au module visco´elastique (Lau et al.,2003).
Il est possible de remonter `a la composante active d’un gel de polym`ere en com-binant une m´ethode passive `a la dynamique du cytosquelette (Mizuno et al.,2007) Cette m´ethode est non-invasive puisque les perturbations ne sont pas appliqu´ees de l’ext´erieur. Un des d´esavantages majeurs de ces techniques est le caract`ere passif, et donc on ne peut pas appliquer de contraintes.