La technique de RET emploie le principe biophysique du transfert d’énergie de résonance, soit de bioluminescence (BRET) (Figure 6B) ou de fluorescence (FRET) (Figure 6C). Ce transfert d’énergie, non radiatif (sans émission de lumière), résulte d’une interaction dipôle - dipôle entre deux molécules, soit la donneuse et l’acceptrice d’énergie. La molécule donneuse d’énergie est une protéine émettant de la bioluminescence, dans le cas du BRET ou émettant de la fluorescence, dans le cas du FRET, alors que la molécule acceptrice d’énergie est une protéine fluorescente dans les deux cas.
9.2.1 La technique de BRET
Dans notre cas, nous utilisons la luciférase de Renilla reniformis (RLuc) en tant que protéine donneuse d’énergie et la protéine fluorescente verte (GFP) en tant qu’acceptrice d’énergie. L’oxydation du substrat de la RLuc, le coelenterazine, provoque une relâche d’énergie qui peut être captée par la molécule acceptrice d’énergie. L’efficacité du transfert d’énergie est dépendant de plusieurs facteurs tels que les
propriétés spectrales, la distance relative et l’orientation relative de la molécule acceptrice et donneuse d’énergie. Afin qu’un transfert d’énergie soit possible, le spectre d’émission de la protéine donneuse doit chevaucher le spectre d’excitation de la protéine acceptrice. Cependant, les deux spectres ne doivent pas être trop semblables, car la résolution spectrale sera perdue, entraînant une trop faible différence entre le ratio signal/bruit de fond. Le transfert d’énergie à lieu si le donneur et l’accepteur se trouvent à moins de 100 Å (10 nm) l’un de l’autre. La détection d’un transfert d’énergie indique donc que le donneur et l’accepteur, et par conséquent les deux protéines qui y sont fusionnées, font partie d’un même complexe protéique [238]. De plus, un très léger changement dans la distance entraîne un très grand effet sur le signal de BRET détecté puisque l’efficacité du transfert est fonction de la distance donneur/accepteur à la puissance 6. Finalement, l’orientation relative des dipôles du donneur et de l’accepteur est critique au transfert d’énergie. Ceci signifie que les molécules donneuses et acceptrices requièrent normalement une liberté de mouvement afin que leur orientation relative soit favorable de temps à autre.
La première génération de BRET appelé BRET1 emploie un substrat pour la RLuc appelé la coelenterazine h. Son oxydation en coelenteramide h résulte en une émission de lumière qui est maximale à environ 480nm. Le transfert d’énergie à la YFP produit une émission maximale à environ 530nm, alors que le transfert d’énergie à la protéine fluorescente verte eGFP produit une émission maximale à environ 510 nm. La deuxième génération de BRET, le BRET2 emploie un substrat nommé DeepBlueC ou coelenterazine 400A et son oxydation résulte en une émission d’énergie maximale à environ 400nm. La molécule acceptrice, la GFP10, une variante de la GFP, a une émission maximale à environ 510 nm. Les protéines eGFP et GFP10 ont un spectre d’émission similaire, mais la GFP10 a été modifiée afin que son spectre d’excitation soit à de plus petites longueurs d’onde. L’avantage principal du BRET2, par rapport au BRET1, est la séparation accrue entre les spectres d’émission du donneur et de l’accepteur, permettant une meilleure résolution du signal. Cependant, les principaux désavantages du BRET2 sont une diminution dans la superposition des spectres
d’excitation et la réduction du rendement quantique de la DeepBlueC, ce qui affecte la sensibilité de cette génération de BRET.
9.2.2 L’analyse des résultats de BRET
Les résultats de BRET sont présentés sous la forme d’un ratio exprimant la quantité de lumière émise par la GFP suivant le transfert d’énergie sur la quantité de lumière émise par la RLuc. Les résultats de BRET peuvent être présentés sous la forme d’une courbe de saturation, utilisant différentes expressions d’accepteurs, ou tout simplement sous la forme d’un graphique à barre pour une valeur unique d’expression de l’accepteur. Dans le cas du graphique à barre, il est important d’exécuter les expériences à des valeurs saturantes atteignant le BRET maximal, afin d’éviter les variations dans le ratio de BRET causées par des variations minimales des niveaux d’expression de l’accepteur et du donneur. Règle générale, les expériences de BRET doivent inclure un contrôle négatif testé en parallèle à l’interaction protéique d’intérêt. Les résultats pourront ensuite être présentés sous la forme de BRET net, où le ratio de BRET du contrôle négatif aura été soustrait des ratios des autres conditions expérimentales. Le contrôle négatif est fait en remplaçant une des protéines d’intérêts, par une protéine, possédant une localisation sous-cellulaire semblable, exprimée à des niveaux similaires, mais n’interagissant pas avec l’autre protéine d’intérêt. Par exemple, lors de l’étude des protéines interagissant avec le β2AR, celui-ci peut être remplacé par
le récepteur CD8, qui est lui aussi un récepteur membranaire, mais qui n’est pas couplé aux voies de signalisation par les protéines G hétérotrimériques.
Suivant l’obtention d’un BRET net positif, d’autres études doivent être effectuées afin de démontrer la spécificité de l’interaction observée. Pour ce faire, deux types d’études peuvent être réalisés, soit les études de compétition ou les courbes de saturation. Les études de compétition consistent à exprimer, en plus des molécules donneuses et acceptrices, des quantités croissantes de l’une ou l’autre des protéines d’intérêts, mais sous leur forme non étiquetée pour faire du BRET. Dans ce cas, si le BRET est spécifique, l’augmentation de la molécule non-étiquetée fera diminuer le
signal de BRET, car il y aura moins de protéines donneuses interagissant avec les protéines acceptrices. Cette réduction du signal de BRET n’a pas lieu en présence d’une protéine n’interagissant pas avec les protéines donneuses ou acceptrices. Les courbes de saturation consistent à exprimer des quantités constantes de protéines donneuses, mais à varier la quantité de protéines acceptrices. Dans ce cas, lorsque toutes les protéines donneuses seront complexées à une protéine acceptrice, nous obtiendrons un BRET maximal, produisant un plateau lors de l’ajout de plus grandes quantités de protéines acceptrices. Dans le cas d’une interaction non spécifique dictée par des collisions aléatoires, les résultats seront représentés par une relation linéaire entre la quantité de protéines acceptrices et le signal de BRET sans jamais atteindre un BRET maximal.