D. F508del-CFTR et la réponse UPR
II. Techniques de biologie moléculaire et de biochimie
Fiche technique N°4
Mesure de l’activité du protéasome
1- Principe
L’analyse de l’activité enzymatique du protéasome a été effectuée par le kit « 20S Proteasome Activity Assay kit ». Elle repose sur la détection du fluorophore-7-Amino-4- methylcoumarin (AMC) libéré après clivage par le protéasome du substrat marqué Leu-Leu- Val-Tyr-AMC. La fluorescence peut être mesurée par un couple de filtre 380/460 nm d’un fluoromètre.
2- Protocole
L’activité enzymatique du protéasome est mesurée sur des cellules cultivées dans une plaque 96 puits jusqu’à atteindre une confluence d’environ 100%, ou bien sur le protéasome 20S purifié du kit. Le test a été réalisé selon les instructions du kit :
- Oter le milieu de culture
- Ajouter 10 µl de 10X Assay Buffer et 80 µl d’H2O. - Déposer dans l’obscurité, 10 µl de substrat LLVY-AMC.
- Après une incubation de 2h à 37°C, mesurer la fluorescence en utilisant un fluoromètre (filtre 380/460).
- Pour la mesure de l’activité enzymatique du protéasome purifié 20S, suivre les instructions du kit.
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Fiche technique N°5 :
Transfection de siRNA (small interfering RNA)
1- Principe
Le siRNA est un ARN double brin de petite taille capable de se lier de manière spécifique sur une séquence d’ARN messager (ARNm) et de le cliver afin d’inhiber sa traduction en protéine. Il est introduit dans la cellule par lipofection, électroporation ou par des vecteurs plasmidiques ou viraux. Une fois dans le cytoplasme, le siRNA active le complexe RISC « RNA Induced Silencing Complex » et le guide jusqu’à l’ARNm cible pour le dégrader. Ainsi, l’expression protéique de la protéine cible est diminuée dans les cellules transfectées (Figure 29).
Figure 29 : Principe de la transfection de siRNA.
2- Protocole
Les siRNA et les réactifs de transfection (siRNA Transfection Reagent et siRNA transfection medium) utilisés dans cette étude proviennent de Santa Cruz Biotechnology. La transfection a été effectuée sur des cellules cultivées jusqu’à 60% de confluence dans des boites de culture de 35 mm de diamètre :
81 - Préparer : Solution A = 100 µl milieu de transfection + 8 µl siRNA
Solution B = 100 µl milieu de transfection + 6 µl agent de transfection - Mélanger la solution B avec la solution A et incuber pendant 45 minutes à température
ambiante.
- Ajouter 800 µl de milieu de transfection au mélange AB. - Laver les cellules avec 2 ml de milieu de transfection. - Déposer le mélange AB sur les cellules.
- Incuber les cellules pendant 7 heures dans l’incubateur (37°C et 5% de CO2).
- Rajouter sur les cellules 1 ml de milieu de culture cellulaire 2 fois supplémenté en milieu de croissance et en antibiotiques.
- Après 24 heures de transfection, éliminer la solution de siRNA et la remplacer par le milieu de culture cellulaire standard.
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Fiche technique N°6 :
Western blot
1- Principe
Le western blot est une technique qui permet de détecter la présence d’une protéine particulière dans un extrait cellulaire. Les protéines sont séparées par électrophorèse en fonction de leur poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide dénaturant puis transférées sur une membrane (nitrocellulose ou PVDF (polyvinylidene difluoride)). Sur cette dernière, la protéine d’intérêt est reconnue par un anticorps spécifique qui à son tour est reconnu par un second anticorps couplé à une enzyme, un fluorochrome ou un isotope (Figure 30).
Figure 30 : Principe de la technique du western blot.
2- Protocole
a) Extraction des protéines
L’extraction protéique est effectuée sur des cellules cultivées jusqu’à 100% de confluence dans des boites de 35 mm de diamètre. Toutes les étapes du protocole sont réalisées sur glace afin de limiter la dégradation des protéines :
- Rincer les cellules trois fois avec du PBS (Lonza) froid.
- Déposer sur le tapis cellulaire 100 µl de tampon de lyse (Tableau 6) additionné d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase (Roche).
Tampon de lyse DOC (deoxycholate) 0.5% (w/v) Nonidet P-40 1% (v/v) Tris HCL 10 mM Pefabloc SC 1 mM pH 7,5
83 - À l’aide d’un grattoir, récupérer les cellules puis les transférer dans un tube eppendorf. - Vortexer pendant 30 secondes puis incuber le lysat cellulaire pendant 30 minutes sur
glace.
- Vortexer de nouveau pendant 30 secondes puis centrifuger le lysat cellulaire pendant 5 minutes à 14 000 rpm et 4°C.
- Récupérer le surnageant (lysat clarifié) puis doser la concentration en protéine totale.
b) Dosage et dénaturation des protéines
La concentration des protéines est déterminée par la méthode BCA (acide bicinchoninique), un dosage colorimétrique basé sur la capacité des protéines à réduire des ions cuivriques Cu2+ en Cu+ lorsqu’elles sont dans un milieu alcalin. Les Cu+ libérés forment avec le BCA un complexe pourpre mesurable à 562 nm. Le protocole utilisé est le suivant :
- Dans un tube, diluer 3 µl de lysat clarifié dans 47 µl d’eau. Pour la solution « blanc », mettre uniquement 50 µl d’eau.
- Ajouter dans chaque tube, 1 ml de la solution BCA préalablement préparée (BCA + sulfate de cuivre dilué au 1/50ème, Thermo Scientific) et incuber pendant 30 minutes à 37°C.
- Mesurer la densité optique à 562 nm.
- La concentration en protéines totales est à déterminer à partir de la densité optique obtenue grâce à une courbe étalon BSA (Bovine Serum Albumin) préalablement établie. - Dénaturer les lysats clarifiés :
o Pour la détection de la protéine CFTR : pendant 1h à 37°C dans du Laemmli 2x [125 mM Tris, 4.5% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), 30% glycerol, 0.002% bleu de bromophenol, 5% α-monothioglycerol].
o Pour les autres protéines : pendant 5 min à 95°C dans du Laemmli 5x (ID1624, Dgel sciences).
c) Electrophorèse et transfert sur membrane
La séparation des protéines est réalisée par électrophorèse SDS-PAGE (Sodium DodécylSulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Il s’agit de séparer les protéines chargées en fonction de leur poids moléculaire qui migrent au travers d’un gel de polyacrylamide en présence de SDS, sous l’influence d’un champ électrique. Le protocole utilisé est le suivant :
84 - Préparer le gel de migration selon les tableaux 7 et 8.
Gel de séparation Gel de concentration
5% 10% 4%
Eau distillée 2.5 ml 2 ml 1.3 ml
Tampon 4X Lower 1 ml 1 ml -
Tampon 4X Upper - - 500 µl
Acrylamide-Bisacrylamide (40%) 500 µl 1 ml 200 µl Persulfate d’ammonium (APS) 10% 40 µl 20 µl TEMED (N,N,N',N'
tétraméthyléthylènediamine) 4 µl 2 µl
Tableau 7 : Composition des gels d’électrophorèse des protéines.
(Le gel de séparation 5% de polyacrylamide est utilisé pour la migration de la protéine CFTR et le gel de 10% de polyacrylamide pour la migration des autres protéines)
Tris SDS 10% pH
Tampon 4X Lower 1.5 M 0.4% 8,8 Tampon 4X Upper 0.5 M 0.4% 6,8
Tableau 8 : Composition des tampons 4X Lower et Upper.
- Une fois polymérisé, placer le gel dans une cuve à électrophorèse, puis remplir la cuve avec le tampon de migration TG-SDS 10X (UP91495E, Interchim) dilué au 1/10ème. - Déposer 50 µg des lysats protéiques dénaturés dans les puits du gel. Afin de faciliter le
suivi de la migration, déposer dans un puits un marqueur de taille coloré RPN800E (GE Healthcare).
- Appliquer un champ électrique de 180 V et 30 mA pendant 1h40 à l’exception de la migration de la protéine CFTR (270 V et 30 mA pendant 1 heure).
- Une fois la migration terminée, récupérer le gel puis réaliser le montage dit en « sandwich » dans le tampon de transfert (Tableau 9), selon la figure 31. La membrane utilisée est de type nitrocellulose (GE Healthcare).
Tampon de transfert
TG-SDS10X (UP91495E, Interchim) 5%
Ethanol 100% 20%
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Figure 31 : Assemblage du sandwich de western blot.
- Mettre le « sandwich » dans la cassette de transfert puis placer l’ensemble dans la cuve de transfert.
- Après avoir rempli la cuve avec le tampon de transfert froid, appliquer un courant de 170 V et 80 mA pendant 1h30 à l’exception du transfert de la protéine CFTR (400 V et 200 mA pendant 1 heure).
d) Immunodétection
Toutes les étapes de cette partie doivent être réalisées à 4°C et sous agitation :
- A l’issu du transfert, récupérer la membrane et la laver trois fois 5 minutes avec du PBS- Tween [tampon PBS contenant 0.01% de Tween-20].
- Incuber la membrane pendant 1 heure dans une solution de saturation, PBS-T contenant 0.5% de lait écrémé.
- Après 3 lavages de 5 minutes, incuber la membrane pendant toute une nuit avec l’anticorps primaire spécifique de la protéine d’intérêt, dilué dans la solution de saturation (Tableau 10).
Anticorps primaires Fournisseur Dilution
Mouse anti-CFTR monoclonal Merck Millipore 1/1000 Mouse anti- Na+/K+-ATPase α1 monoclonal 1/1000
Goat anti-EDEM1 polyclonal 1/1000
Rabbit anti-EDEM2 polyclonal Santa Cruz 1/2000 Goat anti-EDEM3 polyclonal Biothechnology 1/10 000 Rabbit anti-ERGIC53 polyclonal 1/10 000
Rabbit anti-VIP36 polyclonal 1/1000
Rabbit anti-Hsp70 polyclonal 1/10 000 Rabbit anti-Hsp90 polyclonal Enzo Life Sciences 1/1000 Rabbit anti-Calnexine polyclonal 1/2000 Rabbit anti-Actine monoclonal Sigma-Aldrich 1/10 000
86 - Le lendemain, laver 3 fois 5 minutes la membrane puis l’incuber pendant 1 heure avec l’anticorps secondaire dilué dans la solution de saturation (Tableau 11). Cet anticorps est couplé à la HRP (horseradish peroxidase) et est dirigé contre les IgG de l’organisme dans lequel l’anticorps primaire utilisé a été produit.
Anticorps secondaires Fournisseur Dilution
Goat anti-Mouse HRP-linked Sigma-Aldrich 1/10 000 Goat anti-Rabbit HRP-linked 1/10 000 Donkey anti-Goat IgG-HRP Santa Cruz
Biothechnology 1/10 000
Tableau 11 : Récapitulatif des anticorps utilisés en western blot.
- Laver la membrane 3 fois 5 minutes.
- La révélation des protéines d’intérêt est réalisée en chambre noire par autoradiographie à l’aide du kit Enhanced ChemiLuminescence (ECL) (WBKLS0500, Merck Millipore): o Incuber la membrane pendant 1 minute avec la solution ECL préalablement
préparée (selon les instructions du kit).
o Couvrir la membrane à l’aide d’un plastique (très fin et transparent), puis appliquer au-dessus un film autoradiographique (GE Healthcare) pendant quelques minutes.
o Récupérer le film, le plonger dans une solution révélatrice, le rincer avec de l’eau, le plonger dans une solution fixatrice puis le rincer avec de l’eau distillée. - Scanner le film et mesurer l’intensité de chaque bande à l’aide du logiciel Photoshop.
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Fiche technique N°7 :
Biotinylation de surface
1- Principe
La biotinylation de surface permet de détecter la présence d’une protéine particulière à la surface cellulaire, de l’isoler et d’estimer sa quantité à un moment donné. Elle est basée, d’une part, sur la capacité de la biotine, une vitamine soluble à se fixer exclusivement aux protéines présentes à la surface cellulaire; et d’autre part, sur sa haute affinité avec la streptavidine, une protéine d’origine bactérienne. La biotine peut être alors utilisée comme appât pour isoler les protéines membranaires à partir d’un lysat cellulaire. Basée sur ce système, plusieurs réactifs de biotinylation de propriétés différentes ont été créés. Dans notre étude, le réactif EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin a été choisi pour ses propriétés qui répondent aux critères pour la détection du canal CFTR. Ce réactif présente en effet, un groupement sulfonate (sulfo- NHS) qui l’empêche de franchir les membranes cellulaires intactes et aussi permet sa fixation covalente aux groupements amines primaires des protéines. De plus, il marque de manière efficace des protéines qui ont une lysine résiduelle accessible et qui sont suffisamment exposées. Le canal CFTR possède 3 lysines, présentes dans les boucles extracellulaires ECL1, ECL3 et ECL4. Et enfin, ce réactif présente un pont disulfure intramoléculaire permettant une élution facile des protéines biotinylées à partir des billes de streptavidine (Figure 32).
Figure 32 : Principe de la biotinylation de surface.
A. Structure du EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin.
88 2- Protocole
Pour notre étude, le kit de réactifs « Pierce™ Cell Surface Protein Isolation Kit » (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé. La technique est réalisée sur des cellules cultivées jusqu’à 100% de confluence dans des boites de 35 mm de diamètre selon le protocole suivant :
- Rincer les cellules avec du PBS froid.
- Diluer la EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin dans du PBS à 0.5 mg/ml.
- Déposer 3 ml de la solution de biotine sur les cellules et incuber sous agitation pendant 30 minutes à 4°C.
- Stopper la réaction par 2 bains successifs avec le tampon Quenching Solution froid. - Rincer les cellules pendant 5 minutes sous agitation à 4°C avec le TBS (Tris Buffer
Saline) froid.
- Effectuer une lyse cellulaire et doser la concentration des protéines récupérées, comme indiqué dans la fiche technique N°6.
- Déposer la NeutrAvidin Agarose dans la colonne, et effectuer des lavages avec la solution Wash Buffer selon les instructions du Kit.
- Déposer le lysat protéique dans la colonne et laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante sous rotation.
- Centrifuger les colonnes pendant 1 minute à 1 000 x g et jeter l’éluât.
- Déposer 500 µl de Wash Buffer additionné d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase (Roche) puis centrifuger pendant 1 minute à 1 000 x g.
- Après avoir jeté l’éluât, répéter cette dernière étape encore 3 fois.
- Eluer les protéines par dénaturation, en incubant les billes avec le tampon Laemmli 2x [125 mM Tris, 4.5% SDS, 30% glycerol, 0.002% bleu de bromophenol, 5% α- monothioglycerol] (à raison de 15 µl pour 100 µg de protéines) pendant 1 heure à 37°C. - Placer les colonnes dans de nouveaux tubes collecteurs et récupérer les protéines
biotinylées par une centrifugation de 2 minutes à 1 000 x g.
- Analyser par western blot (voir la fiche technique N°6) le contenu des échantillons biotinylés ou stockés à -20°C.
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Fiche technique N°8 :
Immunomarquage indirect
1- Principe
L’immunomarquage est une technique qui permet de détecter et/ou localiser un antigène au sein d’un tissu ou une cellule au moyen d’anticorps. Après fixation et perméabilisation des membranes cellulaires, un anticorps primaire se fixe par spécificité sur l’antigène étudié. Cet anticorps est à son tour reconnu par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (Figure 33). Le complexe ainsi formé « protéine-anticorps primaire-anticorps secondaire » est ensuite visualisé par microscopie à fluorescence suite à une excitation lumineuse du fluorochrome qui va émettre une fluorescence.
Figure 33 : Principe d’immunomarquage indirect.
2- Protocole
La technique est réalisée sur des cellules cultivées jusqu'à 80% de confluence sur lamelles de verre de 12 mm (déposées dans les puits d’une plaque 24 puits). Toutes les étapes du protocole suivi sont réalisées sous agitation et, sauf contre-indication, à température ambiante :
- Laver les cellules 3 fois 5 minutes avec le tampon TBS [157 mM NaCl, 20 mM Tris Base, pH 7.4].
- Fixer les cellules avec du méthanol froid pendant 20 min à -20°C.
- Après 3 lavages de 5 minutes, perméabiliser les membranes cellulaires pendant 15 minutes à température ambiante avec 0.1% de Triton X-100 dilué dans le TBS.
- Laver 3 fois 5 minutes les cellules puis les incuber pendant 1 heure en présence d’une solution de saturation TBS contenant 1% de BSA (Bovine Serum Albumine) et 0.05% de saponine (TBS-BSA-Saponine).
90 - Eliminer la solution et incuber les cellules pendant toute une nuit à 4°C en présence de/des anticorps primaire(s) approprié(s) dilué(s) dans la solution de saturation (Tableau 12).
Anticorps primaires Fournisseur Dilution
Mouse anti-CFTR monoclonal R&D system 1/100
Goat anti-EDEM1 polyclonal 1/50
Rabbit anti-EDEM2 polyclonal Santa Cruz 1/50 Goat anti-EDEM3 polyclonal Biothechnology 1/50 Mouse anti calnexin polyclonal 1/50 Rabbit anti calnexin polyclonal Enzo Life Sciences 1/200
Tableau 12 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps primaires utilisés.
- Laver les cellules 3 fois 5 minutes puis les incuber pendant 1 heure en présence de/des anticorps secondaire(s) (dirigé contre les IgG de l’organisme dans lequel l’anticorps primaire a été produit) dilué(s) dans la solution de saturation (Tableau 13).
Anticorps secondaires Fournisseur Dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 1/100 Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 555 Thermo Fisher 1/50 Donkey anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 Scientific 1/50 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 647 1/50
Tableau 13 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps secondaires utilisés.
- Après 2 lavages au TBS, monter les lamelles sur des lames de verre à l’aide d’un milieu de montage avec DAPI (Sigma-Aldrich). Le DAPI, un agent qui s’incorpore dans le noyau et se lie préférentiellement aux bases A-T de l’ADN (acide désoxyribonucléique) permet de marquer les noyaux des cellules.
- Conserver les lames à 4°C jusqu’à leur observation au microscope.
Les observations microscopiques ont été réalisées à la plateforme ImageUp (Université de Poitiers), sur un microscope confocal FV1000 Olympus équipé d’un microscope inversé à fluorescence (IX-81, Olympus). Les marquages fluorescents ont été obtenus par une excitation des échantillons à 543 nm (rouge), 633 nm (rouge lointain) et 405 nm (DAPI). La fluorescence émise a été détectée entre 555-655 nm pour le rouge, 650 nm pour le rouge lointain et entre 425-475 nm pour le DAPI. Les images ont été obtenues à l’aide d’un objectif x60. Le logiciel Fluoview v1.6 a été utilisé pour l’acquisition des signaux et le traitement des images.
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Fiche technique N°9 :
In situ Proximity Ligation Assay (Duolink)
1- Principe
La méthode in situ Proximity Ligation Assay (PLA) est une technique hautement spécifique et sensible qui permet de détecter, visualiser et quantifier au sein d’un tissu ou d’une cellule des interactions protéine/protéine, l’expression des protéines seules, ou encore, des modifications post traductionnelles, telle que la phosphorylation. La détection de l’interaction entre deux protéines cibles est basée sur l’utilisation de deux anticorps secondaires (PLA-probe PLUS et PLA-probe MINUS), conjugués chacun avec un fragment d’oligonucléotides. Ces deux fragments étant complémentaires entre eux, s’hybrident lorsque la distance entre les deux protéines cibles est inférieure ou égale à 40 nm. Cette hybridation est maintenue grâce à une ligase puis amplifiée grâce à une polymérase qui incorpore des bases qui fluorescent dans le rouge (Figure 34).
Figure 34 : Principe de la technique de Duolink.
2- Protocole
La manipulation est effectuée sur des cellules cultivées jusqu’à 80% de confluence sur lamelles de verre de 12 mm (déposées dans les puits d’une plaque 24 puits). Le kit Duolink in situ kit (Olink Biosciences) a été utilisé :
- Laver les cellules 3 fois 5 minutes avec le tampon TBS.
- Fixer les cellules pendant 20 minutes à température ambiante avec une solution de paraformaldéhyde (PAF) diluée à 3% dans le TBS.
- Après 3 lavages de 5 minutes, perméabiliser les membranes cellulaires pendant 10 minutes à température ambiante avec du Triton X-100 dilué à 0.1% dans le TBS. - Après 3 nouveaux lavages, incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante
92 - Ôter la solution de saturation et incuber les cellules à 4°C pendant toute une nuit sous agitation avec les anticorps primaires dilués dans le tampon de saturation (Tableau 14). Ces anticorps, dirigés chacun contre une des deux protéines d’intérêt doivent être produits dans deux espèces différentes.
Anticorps Fournisseur Dilution
Duolink CFTR avec les protéines :
Goat anti-EDEM1 polyclonal 1/200
Rabbit anti-EDEM2 polyclonal Santa Cruz Biotechnology 1/500
Goat anti-EDEM3 polyclonal 1/1000
Rabbit anti-Hsp70 polyclonal 1/300
Rabbit anti-Hsp90 polyclonal Enzo Life Sciences 1/300 Rabbit anti-Calnexin polyclonal 1/300 Mouse anti-CFTR monoclonal Merck Millipore 1/100
Duolink CFTR avec les protéines :
Rabbit anti-VIP36 polyclonal Santa Cruz 1/500 Rabbit anti-ERGIC53 polyclonal Biotechnology 1/1000 Mouse anti-CFTR monoclonal Merck Millipore 1/500
Tableau 14 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps utilisés en Duolink.
- Le lendemain, mélanger les deux sondes PLA PLUS et PLA MINUS diluées à 1/5 dans la solution de saturation et laisser incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Chaque sonde doit être dirigée contre l’espèce de l’un des anticorps primaires utilisés. - Laver les cellules 2 fois 5 minutes avec la solution de saturation puis les incuber pendant
1 heure à 37°C en présence du mélange PLA PLUS + PLA MINUS.
- Après 2 lavages avec la solution de lavage A [0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20], incuber les cellules pendant 30 minutes à 37°C en présence d’une solution d’eau purifiée contenant la solution de ligation et la ligase, à 1/5 et 1/40 respectivement. - Après deux nouveaux lavages de 2 minutes avec la solution de lavage A, incuber les
cellules pendant 100 minutes à 37°C en présence d’une solution d’eau purifiée contenant la solution d’amplification et la polymérase, diluées à 1/5 et 1/80 respectivement.
- Laver les cellules 2 fois 10 minutes avec une solution de lavage B 1X [0.2 M Tris, 0.1 M NaCl] puis 1 fois 1 minute avec la solution de lavage B à 0,01X.
- Monter les lamelles sur des lames de verre à l’aide d’un milieu de montage contenant le DAPI (marqueur des noyaux cellulaires).
- Une fois séchées, les lames sont observées en microscopie comme décrit précédemment en fiche technique N°8.
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