Techniques d’analyses moléculaires et structurales

3.3.3.1 Séparation des acides humiques et fulviques

Le principe de séparation des acides humiques (AH) et des acides fulviques (AF) des SH repose sur leur différence de solubilité à pH acide (Figure 3 p13). Dans un godet à centrifugation, le pH des SHB est abaissé de 13 à 2 par l’ajout d’H2SO4 concentré favorisant ainsi la précipitation des acides humiques. Les échantillons sont placés sur table d’agitation pendant 2 heures puis stockés en chambre froide une nuit. Les godets sont centrifugés 30 minutes à 6000 tours /min permettant la séparation des fractions humiques et fulviques en deux phases. La phase soluble (AF) est prélevée et la phase insoluble (AH précipités) est remise en solution à l’aide de soude (NaOH) 1N. Les concentrations en carbone organique de chaque fraction sont déterminées par dosage au dichromate de potassium (§ 3.3.2.3).

La quantité totale de carbone de chaque fraction est calculée :

Concentration de la fraction x volume total de la fraction

Le pourcentage de chaque fraction est exprimé en fonction de la quantité totale de carbone de l’échantillon de départ :

% AH = (quantité AH x 100) / (quantité AH + AF)

Le rapport AH/AF exprime les proportions respectives des fractions humiques et fulviques dans un échantillon.

3.3.3.2 Spectrophotométrie UV-Visible - Rapport E472 /E665

L'absorption moléculaire dans la région UV est directement liée à la structure électronique de la molécule. Les rayonnements ultraviolets peuvent exciter les atomes en fournissant aux électrons des couches externes suffisamment d'énergie pour atteindre des niveaux d’énergie plus élevés. La structure électronique étant différente suivant les molécules, les spectres d’absorption correspondant sont différents. Les spectres d’absorption des substances humiques ont été observés entre 200 nm et 400 nm, à des valeurs de pH différentes.

Le rapport de Welt (ratio E4/E6) est largement employé pour caractériser le matériel humique. Il est déterminé par la mesure des absorbances à 472 nm (E4 pour E472) et 665 nm (E6 pour E665) de solutions humiques diluées.

De nombreux paramètres agissent sur la valeur de ce rapport et rendent son interprétation difficile :

• Le ratio E4/E6 varie selon le type d’extrait humique mais il est indépendant de la concentration en matières humiques (Chen et al., 1977; Kononova, 1966; Schnitzer and Khan, 1972). Notons cependant que la mesure de l’absorbance à 472 nm et 665 nm est impossible pour des concentrations de solutions trop élevées.

• Le ratio E4/E6 varie inversement au poids moléculaire (PM) des particules. Les particules de PM élevé (acides humiques) présentent un ratio faible (<5), celles de PM faible (acides fulviques) présentent un ratio élevé (5< E4/E6<10) (Chen, 1977). • En accord avec l’observation précédente, les teneurs en carbone, en oxygène, en

groupements carboxyliques et l’acidité totale des molécules, sont corrélées avec le ratio E4/E6. Ainsi, un faible ratio est associé à une forte teneur en carbone, une faible teneur en oxygène, en groupements carboxyliques et une faible acidité totale (caractéristiques des acides humiques). Inversement, un ratio élevé indique une faible teneur en carbone, une forte teneur en oxygène, en groupements carboxyliques et une acidité totale importante (caractéristiques des acides fulviques).

• Le pH influe de manière indirecte sur la valeur du ratio E4/E6. Le ratio augmente avec le pH jusqu'à des valeurs comprises entre 6 et 8.

Les échantillons de SHB sont dilués dans de l’eau distillée pour atteindre une concentration comprise entre 200 et 400 mg.L-1. Leur pH est ajusté entre 6 et 7 (Kononova, 1966 ; Chen et al., 1977). La densité optique des SHB est mesurée dans des cuves en quartz à 472 et 665 nm. Le zéro est établi avec de l’eau distillée.

3.3.3.3 Chromatographie Gel Sephadex

La filtration sur gel permet de séparer les molécules d’une solution selon leur taille et leur forme. Elle permet d’observer la répartition des molécules des SHB en fonction de leur poids moléculaire. Cette chromatographie est constituée d’une phase stationnaire, gel formé par des billes hydratées comportant en surface des pores étroits, et d’une phase mobile constituée

d’un éluant qui entraînera les molécules à travers la colonne. Le tamisage moléculaire repose sur la capacité des molécules à pénétrer dans les pores de la phase stationnaire (1 Figure 16). Dans une solution aqueuse, composée de molécules de différentes tailles, traversant une colonne, les grosses molécules ne pénètrent pas dans les pores (2 Figure 16 - limite d’exclusion) et sont éluées plus rapidement (3 Figure 16).. Les plus petites entrent dans les pores et se déplacent plus lentement (4 Figure 16).

Figure 16 : Principe de la chromatographie d’exclusion

La séparation des molécules est effectuée selon leur vitesse d’élution, vitesse inversement proportionnelle à la taille et l’encombrement des molécules. La phase stationnaire utilisée est un gel de type sephadex G25 coarse constitué de billes de dextran (polymère de glucose de haut poids moléculaire) permettant de séparer des molécules de 1000 à 5000 daltons. Le type de gel varie selon le poids moléculaire des billes. En fonction du volume final du gel et du coefficient de gonflement des billes, une masse de poudre sèche est déterminée et mise à gonfler dans de l’eau distillée pendant 24 heures. Le gel est ensuite transféré dans une colonne de chromatographie (LKB). Un temps de décantation d’au moins 6 heures doit être respecté afin d’obtenir un gel tassé et un lit de gel plat. Afin d’homogénéiser les conditions de migration, le pH des échantillons est neutralisé à 7 avec de l’acide nitrique (HNO3). Le volume d’échantillon déposé varie inversement à sa concentration en carbone de manière à ce que chaque échantillon séparé contient la même quantité de carbone. Le dépôt de l’échantillon ne pas perturber la surface du lit du gel ce qui diminuerait la

distillée. Le débit volumétrique st réglé à 20 ml/h. Les volumes élués sont recueillis en fraction de 2 ml et leur densité

té indépendamment des dimensions du lit du gel ou du est réalisé délicatement pour

résolution de la séparation. L’élution est réalisée avec de l’eau e

optique (DO) à 350 nm est déterminée. Les résultats sont exprimés en Kav, coefficient qui définit le comportement d’un solu

total du gel (hauteur x surface du gel).

xtran).

est ainsi possible d’établir une relation linéaire entre le Kav et le poids moléculaire. Les 0 (Kav d’exclusion) valeur correspondant aux particules e haut poids moléculaire et 1 (Kav maximum) valeur correspondant aux particules de faible

1 ou 2 mm dans du romure de potassium à une concentration d'environ 1% en masse et soumis à une pression de 20 bar/cm. La pastille ainsi formée est analysée au spectrophotomètre (Perkin Elmer). Les pectres d’absorption infra rouge ont été mesurés entre 400 et 4000 cm-1 et enregistrés par un tenu représente I/I0 = f(τ) avec I = intensité bsorbée, I0= intensité initiale, τ nombre d'onde = 1/λ exprimé en cm-1.

Kav = (Ve-Vo) / (Vt-Vo)

Ve = le volume d’élution d’un soluté est le volume nécessaire pour éluer ce soluté de la colonne après son dépôt sur le gel.

Vt = le volume

Vo = le volume d’exclusion = volume d’élution nécessaire pour exclure du gel des molécules dont le poids moléculaire est supérieur à la limite haute du gel (volume de l’espace qui entoure les billes). La détermination du volume d’exclusion est mesurée par le volume d’élution d’un soluté de masse moléculaire connue et supérieure à la limite d’exclusion du gel (bleu de

Il

valeurs du Kav son comprises entre d

poids moléculaire. Un Kav supérieur à 1 résulte d’une adsorption des molécules sur la matrice du gel.

3.3.3.4 Spectrométrie infrarouge

La spectrométrie infrarouge est une technique d'analyse structurale fonctionnelle basée sur l’analyse vibrationnelle des liaisons. Elle permet de caractériser les fonctions chimiques de produits organiques. Une molécule soumise à des radiations dans l'infrarouge peut absorber certaines d'entre elles à des longueurs d'onde qui correspondent aux fréquences de vibration des groupements chimiques qui la constituent. La mesure de l'intensité de lumière absorbée à chaque longueur d'onde λ conduit à un spectre caractéristique du produit étudié. Par comparaison avec les spectres d'absorption infrarouge de substances de référence, il est possible d'identifier les substances inconnues. Les analyses sont effectuées en transmission. L’échantillon de SHB lyophilisées est préparé par micropastillage de

b 1 s

logiciel TABEL tous les 1 cm-1. Le spectre ob a

le d'une fine couche conductrice d'or ou de carbone transparent aux électrons afin d’éviter les phénomènes de charge induisant des déplacements d'images dues à des décharges soudaines de la surface. Si la surface est conductrice, les charges électriques sont écoulées par l'intermédiaire du porte-objet. Les observations de la sciure, des résidus de sciure extraits et des SH de sciure dialysée, et lyophilisée ont été réalisées à des grossissements de 40X à 800X.

3.3.3.5 Microscopie électronique à balayage

Le principe de la microscopie électronique à balayage consiste à explorer la surface d’un échantillon par lignes successives et à transmettre le signal du détecteur à un écran cathodique dont le balayage est exactement synchronisé avec celui du faisceau incident. Les microscopes à balayage utilisent un faisceau très fin qui balaie point par point la surface de l'échantillon. Sous l'impact du faisceau d'électrons accélérés, des électrons rétro diffusés et des électrons secondaires émis par l'échantillon sont recueillis sélectivement par des détecteurs qui transmettent un signal à un écran cathodique dont le balayage est synchronisé avec le balayage de l'objet. La résolution spatiale dépend de l'énergie des rayonnements. Cette nouvelle technologie a permis, du fait de sa profondeur de champ, l'observation du relief d'échantillons massifs. L'échantillon, placé dans la chambre du microscope, reçoit un flux d'électrons très important. L'observation des échantillons nécessite une étape de métallisation, dépôt préalab

La figure 17 résume la synthèse et les analyses effectuées sur les différents échantillons

P

F

M

P

C

cellulose Lignine Mélange

Analyses élémentaires

Calcul du taux de cendre

Dosage du carbone

Chromatographie ionique

Acidité totale, carboxylique phénolique

Complexometrie

Analyse minérale

Analyses des fibres

Analyses Elémentaires Analyses Moléculaires et Structurales

Séparation des fractions humiques et fulviques

Spectrophotométrie UV Visible

Chromatographie d’exclusion

Spectrométrie infrarouge

Microscopie électronique à balayage

RS RC RH RL RM