Chapitre 2 Outils spectroscopiques et chimiométriques au service
2.3 Techniques de corrections spectrales
2.3.1 Corrections de ligne de base
Les techniques de correction de ligne de base sont utilisées lorsque les spectres acquis présentent une déviation de cette base, traduisant la présence d’un fond présent sur les spectres qui peut numériquement être supprimé (Figure 2.5). Ainsi, deux techniques existent principalement : la technique « detrend » (signifiant littéralement « enlevé la tendance ») et la correction par les moindre carrés pondérés (WLS pour Weighted Least Squares).
Chapitre 2 Outils spectroscopiques et chimiométriques au service des biotechnologies
Figure 2.5 Représentation d'une correction de ligne de base. En bleu, le spectre brut (au dessus) puis corrigé (en dessous), en rouge, la ligne de base soustraite.
Les deux techniques fonctionnent sur le même principe. Il s’agit d’ajuster un polynôme de degré 𝑘 puis le soustraire au spectre. La différence entre les deux techniques provient du système d’ajustement du polynôme. Dans le cas de la correction WLS, un algorithme itératif basé sur les moindres carrés est employé en affectant un poids à chaque point du spectre. Finalement, le spectre prétraité est calculé tel que
𝐱𝐢,𝐜𝐨𝐫𝐫𝐢𝐠é= 𝐱𝐢,𝐛𝐫𝐮𝐭− 𝐝 (2.16)
avec 𝐱𝐢,𝐜𝐨𝐫𝐫𝐢𝐠é le spectre corrigé, 𝐱𝐢,𝐛𝐫𝐮𝐭 le spectre brut et 𝐝 le polynôme calculé selon la
technique de correction de ligne de base employée. Cependant, il faut noter que la difficulté à déterminer le degré du polynôme de correction est un inconvénient majeur de ces techniques de correction. C’est pourquoi les dérivations sont privilégiées pour la correction de ligne de base.
2.3.2 Dérivées spectrales
De manière générale, les spectres acquis mettent en avant la corrélation entre la nature physico-chimique des procédés observés et les intensités des bandes ou pics mesurés. Les interprétations et les calculs sont alors directement opérés sur les spectres. Néanmoins, l’utilisation des spectres dérivés s’est avérée plus intéressante dans l’analyse des données tant ces spectres améliorent l’interprétation des positions ou des largeurs de bandes. Ainsi, la dérivée première permet de mettre en avant les largeurs de bandes puisque les maxima et minima du spectre dérivé représentent les intensités à mi-hauteur des bandes du spectre brut (Figure 2.6 ci-dessous). Les dérivées secondes quand à elles permettent de mettre l’accent sur les positions des bandes (Figure 2.6).
Chapitre 2
Outils spectroscopiques et chimiométriques au service des biotechnologies
Figure 2.6 Représentation des effets de la dérivation, en particulier sur différents effets. En rouge, un effet multiplicatif sur la ligne de base, en vert un effet additif, en bleu un spectre sans déviation de ligne de
base et en pointillés noir, les abscisses nulles.
De plus, les techniques de dérivation sont particulièrement utiles pour éliminer les effets de ligne de base sur les spectres acquis. La Figure 2.6 reprend les différents effets de ligne de base (additifs et multiplicatifs) sur les signaux acquis ainsi que les conséquences de la dérivation.
Il existe aujourd’hui plusieurs moyens de calculer la dérivée d’un spectre. La première méthode calcule simplement la dérivée en un point considérant les valeurs à des distances spécifiques en fréquence (ou gap). Ainsi, la dérivée peut s’écrire sous la forme :
d𝐲 d𝑥𝑖=
𝑦𝑖+𝑔𝑎𝑝/2− 𝑦𝑖−𝑔𝑎𝑝/2
𝑥𝑖+𝑔𝑎𝑝/2− 𝑥𝑖−𝑔𝑎𝑝/2 (2.17)
avec 𝑦𝑖 l’intensité à la variable 𝑖, 𝑥𝑖 la fréquence ou longueur d’onde pour cette même variable et enfin 𝑔𝑎𝑝 un écart déterminée. De cette façon il est possible de déterminer la dérivée par simple différence entre deux points. Une application particulière de cette dérivée est la dérivée dite de « simple différence » qui prend un gap de 2 points. Ainsi, les dérivées sont calculées sur les points adjacents des valeurs. Par la suite, les dérivées d’ordre deux voire plus sont réalisées sur les dérivées de l’ordre précédent : les dérivées secondes sont issues de dérivations des spectres de dérivée première, et ainsi de suite.
À l’origine, l’intégration d’un gap dans la formule permettait de réduire le bruit qui était observé sur les spectres dérivés par rapport aux résultats prenant en compte seulement les points adjacents [82]. Cependant, l’étroitesse des bandes spectrales, notamment en spectroscopie Raman, empêche l’application de distances de calcul élevées et donc la réduction du bruit. C’est pourquoi la méthode de dérivation Savitzky-Golay a été proposée
Chapitre 2 Outils spectroscopiques et chimiométriques au service des biotechnologies
[83]. Cet algorithme calcule la dérivée au point 𝑖 en commençant par ajuster un polynôme de degré 𝑘 sur une fenêtre spectrale de 𝑓 points (𝑓 ≥ 𝑘 + 1) centrée autour de la variable 𝑖. L’équation du polynôme déterminée, celui-ci est alors dérivé selon l’ordre indiqué par l’utilisateur. La fenêtre 𝑓 balaye ensuite la totalité du spectre afin de générer le spectre dérivé.
L’avantage de cette technique réside dans le lissage opéré par l’algorithme de Savitzky- Golay sur le spectre. Ceci permet donc d’atténuer l’augmentation du niveau de bruit engendré par la dérivation du spectre. Nous pouvons également noter que l’algorithme Savitzky-Golay peut également être employé comme technique de lissage uniquement en fixant l’ordre de dérivée à zéro. L’étape de dérivation n’entre alors pas en compte après avoir ajusté le polynôme sur la fenêtre spectrale.
De manière générale, les dérivées sont également employées pour la correction de déplacements de ligne de base ou de déplacements multiplicatifs du fond spectral. D’autres techniques plus spécifiques permettent également de corriger spécifiquement ces différents déplacements.
2.3.3 Techniques de normalisation
Les techniques de normalisation sont utilisées afin de minimiser la variabilité qui existe au sein d’un lot de spectres. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour parvenir à normaliser les spectres. Une des techniques les plus simples consiste à considérer l’aire sous les spectres. En divisant chaque spectre par la somme des valeurs absolues des intensités de chaque variable, les aires sous chacun des spectres sont ramenées à 1. Cette méthode a rapidement été remplacée par deux autres techniques, très utilisées aujourd’hui pour normaliser les signaux : les normalisations Multiplicative Scatter Correction (MSC) et
Standard Normal Variate (SNV).
La technique de normalisation MSC corrige chaque spectre de l’ensemble de données par un spectre de référence, généralement le spectre moyen du lot. Un modèle linéaire est ajusté entre le spectre à corriger 𝐱𝐢 et le spectre de référence 𝐱𝐫𝐞𝐟 tel que
𝐱𝐢= 𝐚𝐢+ 𝐛𝐢 𝐱𝐫𝐞𝐟+ 𝐞𝐢 (2.18)
où 𝐚𝐢 et 𝐛𝐢 sont les vecteurs de coefficients de régression calculés à partir du spectre 𝐱𝐢 à corriger et du spectre de référence 𝐱𝐫𝐞𝐟. Ainsi, les spectres sont normalisés suivant l’équation (2.19) en utilisant les coefficients calculés équation (2.18), considérant 𝐱𝐢,𝐌𝐒𝐂 comme le
Chapitre 2
Outils spectroscopiques et chimiométriques au service des biotechnologies
𝐱𝐢,𝐌𝐒𝐂 =𝐱𝐢− 𝐚𝐢
𝐛𝐢 (2.19)
La méthode de normalisation SNV s’appuie non pas sur des coefficients déterminés à partir d’un spectre de référence mais spécifiquement sur la moyenne ainsi que l’écart-type calculés pour l’ensemble des éléments du spectre à normaliser. Ainsi, pour chaque spectre à corriger 𝐱𝐢, la normalisation SNV applique l’équation (2.20), telle que
𝐱𝐢,𝐒𝐍𝐕=
𝐱𝐢− 𝜇
𝜎 (2.20)
en prenant 𝜇 la moyenne de l’ensemble des éléments du spectre à normaliser, 𝜎 l’écart-type à la moyenne des mêmes éléments et 𝐱𝐢,𝐒𝐍𝐕 le spectre normalisé par la méthode SNV.
2.3.4 Méthodes de mise à l’échelle et de centrage
Les techniques de mise à l’échelle (scaling) et de centrage (centering) s’appliquent, non pas à un seul spectre, mais à l’entièreté du jeu de données à traiter. Les prétraitements dits de « scaling » effectuent une division de chaque variable spectrale par une valeur donnée. Un scaling très utilisé consiste à diviser chaque variable par son écart-type, calculé à partir des valeurs des éléments de chaque spectre à la variable donnée. Ainsi, chaque élément spectral dispose du même impact sur la variabilité générale, traduit par un écart-type unique égal à 1. Cette technique n’est que très rarement utilisée en spectroscopie puisqu’elle entraîne la surévaluation des régions spectrales sans signaux, zones de bruit n’ayant pas autant d’impact que les bandes spectrales lors d’analyses multivariées notamment.
Les méthodes de centrage ou centering consistent à centrer les données autour d’un spectre de référence déterminé. De manière générale, le centrage par la moyenne (Mean
Center) est la technique la plus employée. Le spectre moyen de l’ensemble est calculé en
prenant les moyennes individuelles des éléments de chaque variable spectrale. Le spectre ainsi obtenu est ensuite soustrait à chaque spectre de l’ensemble de données. Ce prétraitement est réalisé de manière systématique pour les calculs d’ACP ou de PLS car cela permet de placer le nouvel espace déterminé par les composantes principales ou les variables latentes au centre de l’espace des variables initial (composé de chaque variable spectrale).
Un prétraitement regroupant les deux types de prétraitement est le prétraitement « autoscale » qui réalise les scaling et centering que nous avons pris en exemple (scaling par l’écart-type et mean centering). Ceci étant, la technique dite autoscale est très peu utilisée en spectroscopie vibrationnelle pour les mêmes raisons que les scaling. L’autoscale est plus répandue sur les analyses multivariées mettant en jeu différents paramètres ayant
Chapitre 2 Outils spectroscopiques et chimiométriques au service des biotechnologies
des variabilités et des moyennes sensiblement différentes. En appliquant cette correction, toutes les variables sont mises au même niveau.
3
État de l’art des suivis métaboliques de cultures
cellulaires
Depuis plusieurs années déjà, la spectroscopie et la chimiométrie sont employées afin d’améliorer les connaissances et les techniques de suivi des bioprocédés. L’initiative PAT de la FDA, lancée dans les années 2000, n’a fait qu’accroitre l’utilisation de ces techniques et l’application des principes d’analyse multivariée pour le suivi de différents paramètres.