B. Le système de sécrétion de type VI
IV. Techniques analytiques des échantillons protéiques
Les bactéries sont cultivées (25 ml) sur la nuit à 28°C avec agitation (180 rpm) avec
induction à l’IPTG 1 mM si besoin. Les cellules sont ensuite centrifugées à 7 500 x g
pendant 5 minutes puis le surnageant est filtré sur membrane 0,2 µm (Millipore) afin
d’éliminer les bactéries résiduelles. Les protéines présentes dans le surnageant sont
ensuite précipitées sur la nuit dans de la glace avec de l’acide trichloroacétique (TCA)
10% final. Après la précipitation sur la nuit, le surnageant est centrifugé à 13 000 x g
à 4°C pendant 30 minutes afin de culotter les protéines. Le culot est lavé deux fois
avec 5 ml d’acétone froid (stocké au -20°C) sans pipetage et centrifugé à 13 000 x g
pendant γ0 minutes à 4°C. Le culot est ensuite séché sous hotte chimique jusqu’à
évaporation de l’acétone. Le culot est repris dans 100 µl de tampon de réhydratation
(tableau 6).
Tableau 6: composition du tampon de réhydratation. CHAPS: 3-[(3-Cholamidopropyl)
dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (Sigma-Aldrich). Tampon IPG 3-10 (Sigma-Aldrich).
Composants Quantité Urée 2,1 g Thiourée 0,76 g CHAPS 0,2 g Tampon IPG 3-10 25 µl Eau milli-Q Qsp 5 ml
2) Séparation des protéines sur gel SDS-PAGE
Les protéines sont séparées par électrophorèse en condition dénaturante SDS-PAGE
(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Le pourcentage
d’acrylamide final des gels SDS-PAGE utilisé est soit de 10, 12 ou 15% pour le gel de
séparation et de 7% d’acrylamide final pour le gel de concentration. La composition de
chaque gel utilisé figure dans le tableau 7. Les échantillons sont repris dans du tampon
Laemmli 2X (6,25 ml de Tris-HCl pH 6,8, 0,5 g de SDS, 2,5 ml de glycérol, 50 µl de
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pendant 5 minutes à 100°C et chargés sur gel SDS-PAGE. La migration s’effectue
avec un ampérage constant (25 mA pour un petit gel et 60 mA pour un grand gel) avec
du tampon de migration (14,4 g glycine, 3,03 g Tris-Base, SDS 0,1 % final, qsp 10 1L).
Tableau 7: Composition des gels SDS-PAGE utilisés au cours de ce travail.
Réactifs séparation Gel de
10% Gel de séparation 12% Gel de séparation 15% Gel de concentration Acryl/bisacrylamide 40% 2.5 ml 3 ml 3.75 ml 2.430 ml Tris-HCl 0.75M pH 8.8 2.35 ml 2.35 ml 2.35 ml --- Tris-HCl 0.75M pH 6.8 --- --- --- 3.45 ml Eau MilliQ 5.1 ml 4.6 ml 3.85 ml 9 ml SDS 20% 60 µl 60 µl 60 µl 114 µl APS 10% 60 µl 60 µl 60 µl 114 µl TEMED 6 µl 6 µl 6 µl 9 µl
3) Western Blot
Après migration sur gel SDS-PAGE, les protéines sont transférées sur membrane
de nitrocellulose 0,2 µm (BioRad) avec un voltage constant de 100 volts pendant 1 h
dans du tampon de transfert (25 ml Tris-Base 1M pH 8,3, 11,26 g glycine, 200 ml
méthanol, qsp 1L). Puis la membrane est lavée dans du tampon de lavage PBS-Tween
(10 ml Tris-Base 1M pH 8,0, 11,7 g NaCl, 500 µl TWEEN® 20, qsp 1L) avec une faible
agitation puis incubée pendant 1 h dans du tampon de blocage (10 g de lait en poudre
dans 100 ml de PBS-Tween). La membrane est lavée dans du tampon de lavage
pendant 15 minutes puis est incubée avec les anticorps primaires (généralement
dilués au 1/2000
èmedans du tampon de blocage pendant 1 h). Puis la membrane est
lavée dans un bain de tampon de lavage trois fois successivement (15 minutes
d’incubation par bain). Ensuite, la membrane est incubée avec les anticorps
secondaires couplés à la phosphatase alcaline pendant 1 h puis lavée trois fois avec
du tampon de lavage. La phosphatase alcaline est ensuite révélée par colorimétrie (AP
conjugate substrate kit, BioRad) selon les recommandations du fournisseur.
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4) Révélation des protéines par coloration au bleu de Coomassie
Après migration sur gel SDS-PAGE, le gel est incubé sur la nuit dans une solution
de coloration contenant du bleu de Coomassie G-250 (Merck) se fixant sur les
protéines (400 ml méthanol, 100 ml acide acétique glaciale, 1 g de bleu de Coomassie
G-250, qsp 1L). Puis le gel est décoloré par plusieurs bains de décoloration (400 ml
méthanol, 100 ml acide acétique glaciale, qsp 1L).
5) Digestion des protéines d’intérêts extraites sur gel SDS-PAGE
Les protéines sont extraites directement sur gel SDS-PAGE à l’aide d’un scalpel
nettoyé à l’éthanol et les fragments de gels sont découpés en petits morceau afin de
faciliter la digestion. Le gel est décoloré dans un bain BICAM 100 mM/acétonitrile (1 :1,
v/v) (BICAM μ 1λλ mg bicarbonate d’ammonium qsp β5 ml) pendant γ0 minutes à
température ambiante, en vortexant toutes les 10 minutes. Si nécessaire, un nouveau
bain de BICAM/acétonitrile peut être utilisé pour les gels encore non décolorés. Une
fois décoloré, le mélange BICAM/acétonitrile est enlevé, puis le gel est desséché avec
500 µl d’acétonitrile pur et incubé pendant 10 minutes environ à température ambiante
jusqu’à ce que le gel apparaisse blanchâtre puis l’acétonitrile est enlevé. La solution
de trypsinolyse (tampon de trypsinolyse + trypsine à 13 ng/µl) (Trypsin Gold Mass
Spectrometry grade, Promega, tableau 7) est ajoutée de façon à recouvrir totalement
la fraction protéique et le tout est incubé dans la glace pendant 30 minutes afin que le
gel absorbe la solution de trypsinolyse. Puis la digestion trypsique a lieu sur la nuit à
37°C. Les peptides digérés à la trypsine sont stockés au -80°C ou analysés
directement par spectrométrie de masse.
Tableau 8: Composition de la solution de trypsinolyse.
Solution Composants Quantité
Tampon de trypsinolyse BICAM 800 µl (100 mM)
Acétonitrile 800 µl
Eau Milli-Q 6,4 ml
Trypsine à 13 ng/µl Acide formique 100 µl
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6) Préparation de plaque pour l’analyse MALDI-TOF
Les échantillons protéiques sont cristallisés avec la matrice HCCA (α
-cyano-4-hydroxycinnamic acid, Bruker Daltonics). Pour la préparation de la matrice HCCA,
environ 10 mg de poudre de HCCA sont repris dans 100 µl d’acide trifluoroacétique
0,β % (TFA) et 100 µl d’acétonitrile pure. Puis le mélange est vortexé et soniqué
pendant 5 minutes dans un bain à ultrason (Branson 2200, 47 kHz ± 6%) puis
centrifugé (1 000 x g pendant 1 minute). 100 µl de surnageant sont mélangés avec
100 µl de TFA 0,2% et 100 µL d’acétonitrile pure.
Un volume de 1,5 µl d’échantillon est déposé sur la plaque MALDI-TOF puis 1,5 µl
de matrice HCCA préparée est déposée sur la goute d’échantillon. La préparation du
calibrant (peptide calibration standard II, Bruker Daltonics) est également déposée de
la même façon (0,5 µl de calibrant puis 0,5 µl de matrice HCCA). Puis les échantillons
sont séchés sous hotte chimique jusqu’à cristallisation des échantillons (environ 1 h).
7) Analyse de protéines par spectrométrie de masse MALDI-TOF
Les échantillons sont analysés par Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF/TOF LIFT, AutoFlexIII, Bruker Daltonics) en mode positif
MH+ contrôlé par le logiciel FlexControl software Version 3.3 selon le protocole décrit
par Barbey (Barbey et al., 2012). Le profil peptidique (PMF : peptide mass
fingerprinting) caractérisé par la masse des différents pics, est renvoyé au logiciel
MASCOT (http://www.matrixscience.com/cgi/nph-mascot.exe) avec une tolérance de
100 ppm. L’analyse statistique des séquences est déterminée selon le score de
Mowse du logiciel MASCOT. Lorsque la P-value est inférieure à 0,05 (seuil p < 0,05),
l’identification protéique est significative.
Le site web http://web.expasy.org/peptide_mass/ permet déterminer in silico des
différents peptides générés par digestion trypsique d’une protéine à partir de sa
séquence afin de comparer à un profil peptidique.
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