Tripomastigotas da Cepa Y foram recolhidas a partir de sobrenadantes de células Vero e distribuídas numa placa de 96 poços a uma densidade final de 4×105 células por poço. Cada inibidor químico foi adicionado às cavidades, em triplicata. Benznidazol foi usado como controle positivo neste ensaio. A placa foi então cultivada durante 24 horas a 37 °C e 5% de CO2. Após este tempo, aliquotas de cada poço foram recolhidas, e o número de parasitos
viáveis (isto é, com a motilidade aparente) foi contado numa câmara de Neubauer. Os poços que não receberam os inibidores químicos foram assumidos como 100% no número de parasitos viáveis. Determinaram-se as curvas de dose-resposta, e os valores de IC50 foram calculados por regressão não linear (Prism, versão 4.0), utilizando pelo menos sete concentrações (pontos de dados).
3.4.2.4 Estudos ultraestruturais
Os parasitos foram cultivados durante 24 h em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) tamponado em pH 7,5 e suplementado com HEPES (20 μM), 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) , e estreptomicina (100 μg/mL) contendo o composto 6k na concentração IC50 e duas vezes o valor de IC50. Os parasitos foram recolhidos, lavados em
PBS e fixados com 2,5% de glutaraldeído, formaldeído a 4%, e tampão de cacodilato 0,1 M em pH 6,8. Eles foram, em seguida, pós-fixados em 2% de tetróxido de ósmio (OsO4) num
tampão de cacodilato 0,1 M em pH 6,8 e processados para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e microscopia electrônica de varredura (MEV).
Para a análise de MEV, os parasitos foram desidratados em etanol graduado e secados pelo método do ponto crítico com CO2. As amostras foram montadas em bases de alumínio,
revestidas com ouro e examinadas sob um microscópio JEOL-5600LV.
Para a análise de TEM, os parasitos foram desidratados numa série graduada de acetona e, finalmente, embebidos em EPON. As seções foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo e observadas com microscópio Tecnai spirit G2 Biotwin.
3.4.2.5 Iodeto de propídio e coloração anexina V
Tripomastigotas (1 × 107) foram incubadas durante 24 h a 37 °C na ausência ou presença do composto 6k. Após a incubação, os parasitos foram marcados com iodeto de propídio (PI) e anexina V usando o kit de detecção de apoptose V-FITC anexina (Sigma- Aldrich), de acordo com as instruções do fabricante. Aquisição e as análises foram realizadas utilizando um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson, CA, EUA) com o software FlowJo (Tree Star, CA, EUA). Um total de 30.000 eventos foi adquirido na região previamente estabelecida como formas tripomastigotas de T. cruzi. Foram realizados dois experimentos independentes.
4 CAPÍTULO 2
Planejamento estrutural, síntese e avaliação das propriedades
antitumorais de inéditas tiazolil-hidrazonas derivadas da isatina
4.1 Revisão da Literatura
4.1.1 Câncer
Câncer (do grego karkinos – caranguejo) é um termo genérico para um grande grupo de doenças que podem afetar qualquer parte do corpo. Outros termos utilizados são tumores malignos e neoplasias (WHO, 2015). Uma característica comum aos tipos de câncer é a proliferação desordenada e a incapacidade de diferenciação celular normal. As células adquirem características de malignidade por meio do processo de progressão tumoral, que consiste no crescimento progressivo, na invasão e na formação de metástases (COSTA, 2011). Hanahan e Weinberg descreveram em sua revisão de 2010, revisada em 2011, o conceito de "hallmarks" do câncer, que seriam as capacidades características que constituem o alicerce lógico para o entendimento dessa patologia. Os Hallmarks do câncer incluem: 1) manutenção de sinalização proliferativa, 2) evasão de supressores de crescimento, 3) ativação de invasão e metástase, 4) possibilidade de imortalidade replicativa, 5) indução de angiogenese e 6) resistência à morte celular (Figura 17). Adicionalmente, duas características cruciais que permitem a aquisição dos seis Hallmarks iniciais foram descritas. São essas: Instabilidade genômica e mutação, e inflamação promotora de tumor (HANAHAN & WEINBERG, 2010;HANAHAN & WEINBERG, 2011).
As pesquisas em câncer tiveram, por muito tempo, um foco reducionista, baseado apenas nas células cancerosas e nos seus genes. Atualmente, os tumores são vistos como tecidos complexos, onde as células tumorais recrutam e subvertem tipos celulares normais, que servem como colaboradores na pauta neoplásica. As características fenotípicas do câncer não dependem unicamente das células tumorais (Figura 18) (HANAHAN, COUSSENS, 2012).
Figura 18. Tumores como tecidos complexos.
A – Visão reducionista. B – Concepção atual, considerando tanto as células tumorais como seu microambiente. Fonte: Adaptado de Hanahan; Weinberg, 2000, 2011.
4.1.2 Epidemiologia do Câncer
Segundo a Organização Mundial de Saúde, o câncer continua sendo uma das principais causas de morte em todo o mundo. Estimou-se para 2012, cerca de 14 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes relacionadas à esta doença. Ainda segundo dados da OMS, o número de novos casos de câncer deverá aumentar em cerca de 70% ao longo das próximas duas décadas (WHO, 2015).
Na ultima estimativa realizada pelo INCA (Instituto Nacional de Câncer) foi esperado para o ano de 2014, o surgimento de aproximadamente 576 mil casos novos de câncer no Brasil. Além disso, estima-se que a carga do câncer continuará aumentando nos países em desenvolvimento e crescerá ainda mais em países desenvolvidos se medidas preventivas não forem amplamente aplicadas. Em 2030, a carga global será de 21,4 milhões de casos novos de
envelhecimento da população, bem como da redução na mortalidade infantil e nas mortes por doenças infecciosas em países em desenvolvimento (INCA, 2014).
4.1.3 Quimioterapia do Câncer
A quimioterapia empregada para tratamento de pacientes com câncer é feita por meio do uso de agentes químicos isolados ou em combinação. Esta estratégia terapêutica é uma das principais atualmente utilizadas, podendo também ser empregada juntamente com outros métodos de forma adjuvante, quando usada após tratamento cirúrgico ou radioterápico curativo; ou previamente a uma remoção cirúrgica, geralmente para reduzir a massa tumoral minimizando a quantidade de lesões durante a cirurgia (COSTA-LOTUFO, 2010).
No entanto, o arsenal quimioterápico disponível para o tratamento do câncer apresenta vários problemas quanto à especificidade, agindo também em células normais, e potencialidade, apresentando valores ainda considerados pequenos de cura total. Além desses fatores, o desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas é um elemento agravante e já com certa frequência de casos na terapêutica do câncer (SHUKLA et al., 2012). Dessa forma, a pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos para a quimioterapia do câncer se fazem necessários.
4.1.4 Derivados da isatina
Um conhecido grupo farmacofórico que apresenta uma notável e conhecida atividade antiproliferativa contra várias linhagens de células cancerosas é o heterociclo isatina (ABOUL-FADL et al., 2012). A recente aprovação pela FDA do oxindol, malato de sunitinibe (Figura 19), como um inibidor de quinase para o tratamento do carcinoma renal avançado e tumores estromais gastrointestinais, destacou, ainda mais, o crescente interesse em isatinas como uma nova classe de agentes antineopláscos. (MOTZER et al., 2006).
Derivados da SU-5416 (semaxanib) e da SU-11248 (sunitinib) (Figura 19) são relatados como potentes inibidores das quinases dependentes de ciclina (CDKs), o que pode induzir apoptose em células de carcinoma de cólon. Shi et al. (1996) obtiveram derivados fenil-hidrazonas de isatinas (Figura 19, I) que também apresentam potente inibição de CDKs
Além da potente inibição de quinase, o mecanismo de ação de outros derivados da isatina inclui a inibição e/ou modulação de proteases, inibição da tradução, da neovascularização e da polimerização da tubulina (VINE et al., 2009). Abadi et al. (2006) identificaram as propriedades antitumorais e antiangiogênicas de imino 2-indolonas (Figura 19, II). Vine et al. (2009) sintetizaram diversos análogos da isatina substituída (Figura 19, III), e testaram em cinco linhas de células cancerígenas humanas, concluindo que isatinas substituídas podem ser efetivos fármacos anticâncer (SOLOMON et al., 2009).
Figura 19. Exemplos de derivados da isatina que apresentam atividade antitumoral.
Fonte: Elaborado pelo autor.
4.1.5 Derivados do tiazol
Outra classe de compostos heterocíclicos que também se destacam pelo amplo espectro de atividades biológicas são os tiazóis. Dentre as atividades relatadas para esse núcleo farmacofórico, destaca-se a potente ação citotóxica frente a diferentes tipos de tumores tais como carcinoma de pulmão, adenocarcinoma de cólon, glioblastoma, melanoma, câncer de próstata e leucemia (LEFRANC et al., 2013; HASSAN et al., 2012; FALLAH-TAFTI et al., 2011; ALIABADI et al., 2010; SOUZA et al., 2005). Como exemplo de agentes antitumorais que apresentam tiazol em sua estrutura, podem ser citados a bleomicina e a
Figura 20. Exemplos de agentes antitumorais contendo o núcleo tiazol.
Fonte: Elaborado pelo autor.
4.1.6 Planejamento das séries
Frente ao exposto, os grupos isatina e tiazol foram escolhidos como grupos farmacofóricos de base, no intuito de obter novos agentes antitumorais. Desse modo, foi utilizada a estratégia química de hibridização molecular, onde as duas estruturas bioativas distintas foram unidas em uma nova estrutura. Com a utilização dessa estratégia pode-se obter um novo composto, conhecido como dual, misto ou duplo em propriedades farmacológicas, o que pode representar uma alternativa terapêutica muito interessante para determinadas fisiopatologias multifatoriais, como é o caso do câncer.
Vine e colaboradores (VINE et al., 2007; VINE et al., 2009) mostraram que algumas isatinas substituídas apresentam ação anticancerígena sobre células humanas de linfoma histiocítica (U937), principalmente as isatinas halogenadas e nitradas na posição C5. Por esse motivo, foram obtidas isatinas com um grupo nitro (NO2) na posição C5 e isatinas com um
halogênio nesta mesma posição. Escolheu-se o substituinte Cl para explorar os efeitos da presença de halogênios nessa posição. Também foram explorados substituintes em torno do anel fenil ligado ao anel tiazol em C4, além de serem feitas substituições na posição N3 também do anel tiazol.
A utilização dos substituintes halogenados possibilita, dentre outras coisas, a melhoria da absorção oral, da permeabilidade, da estabilidade metabólica e química, a formação de ligação halogênio no alvo farmacológico contribuindo para a estabilidade da ligação fármaco- receptor, além das contribuições estéricas dessa classe na interação com alvos farmacológicos
Estas técnicas empregadas permitem uma análise da relação estrutura-atividade (SAR). As variações estruturais realizadas nas moléculas são confrontadas com as variações no potencial de atividade biológicas dessas moléculas. Dessa forma, pode-se apurar a especificidade de cada uma delas e observar quais variações foram benéficas ou prejudiciais para a atividade (Figura 21).
Figura 21. Planejamento estrutural dos compostos propostos
4.2 Resultados e discussão