Le système ComR/ComS

Le récepteur ComR, initialement nommé Ster_0316 fait partie de la famille des RNPP de streptocoque appelés Rgg-like (FONTAINE, BOUTRY, et al. 2010). Avec son peptide ComS,

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ComR constitue un système QS alternatif au système à 2 composants ComCDE (Figure 13) pour réguler la compétence via le facteur sigma ComX/SigX mais aussi la synthèse de bactériocine pour lier la compétence à la prédation (WENDERSKA et al. 2012) (MIGNOLET et

al. 2018) (Figure 30). La majorité des espèces ne possèdent que l’un des systèmes ComCDE ou ComRS, mais certaines d’entre elles, comme S. mutans, possèdent les deux (Martin et al. 2006)

Figure 30 : Schéma ComRS chez S. mutans.

Le système direct ComRS va sécréter un précurseur ComS pour donner un peptide mature que l’on nomme XIP. Ce peptide va être réinternalisé pour se fixer sur le régulateur transcriptionnel ComR. Le complexe ComR/XIP va ainsi pouvoir réguler les gènes ComR et ComS pour sa propre auto régulation positive mais aussi ComX qui code pour SigX le maitre régulateur de la compétence chez les Streptocoques et enfin différents gènes comme

blpK et slvX qui sont impliqués dans la synthèse de bactériocines.

L’analyse des séquences de la forme mature de ComS, appelée XIP (pour ComX/SigX Inducing Peptide), a permis de classer les systèmes ComRS en 3 types différents (Figure 31). Les peptides de type I, caractérisés par la présence d’un motif (V/L) P (F/Y), sont observés chez les 3 espèces du groupe salivarius, i.e. S. salivarius (LPYFTGCL), S. thermophilus (LPYFAGCL) et S. vestibularis (VPFFMIYY). Le type II quant à lui correspond aux peptides possédant un motif « WW » avec dans certains cas des résidus acides (D ou E) et/ou basiques (K, R ou H). C’est le système ComRS qui se trouve entre autres dans les espèces de Streptococcus les plus

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pathogènes (S. pyogenes M1GAS (SAVDWWRL) et S. mutans UA159 (MGLDWWSL)). Parce qu’il ne rentrait pas dans les deux groupes précédents, le peptide XIP de S. suis (WGTWVEE) qui contient deux résidus aromatiques non adjacents, a été classé dans un type III.

Figure 31 : Classification des voies de compétence chez les Streptocoques (SHANKER et al. 2016) Le système ComRS de type I se trouve dans le groupe Salivarius (en jaune). Le système ComRS de type II est

présente dans les groupes de Bovis, Mutans et Pyogenes (en rouge). Le système ComRS de type III est caractéristique du groupe Suis (en violet). Les groupes Anginosus et Mitis (en bleu) présentent quant à eux le

système ComCDE.

Il a été montré que, suivant les espèces, la taille minimale active du XIP est comprise entre 7 et 9 résidus (FONTAINE, DANDOY, et al. 2010; MASHBURN-WARREN et al. 2010; DESAI et al. 2012; KHAN et al. 2012; MORRISON et al. 2013; MARKS et al. 2014; ZACCARIA et al. 2014). Chez S. thermophilus, la production de ComS dans des conditions artificielles a montré que la peptidase Eep pouvait maturer ComS en un peptide XIP de différentes tailles, avec une forme majoritaire de 11 résidus. Néanmoins, on ne sait pas si les différentes longueurs de ComS cohabitent ou non dans les souches sauvages (FONTAINE et al. 2013; GARDAN et al. 2013).

L’analyse structurale du système ComRS de S. thermophilus (TALAGAS et al. 2016) a montré

que la structure de la forme apo de la protéine (Code PDB : 5JUF), est un monomère caractérisé par la séquestration de l’hélice α3 du domaine HTH par le domaine TRP (Figure 32).

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Figure 32 : Structure de la forme apo de ComR.

A- Monomère de ComRSth apo (Code PDB : 5JUF) représenté en cartoon et coloré en gradient de couleur du

bleu (domaine HTH N-terminal) au violet (hélice CAP C-terminale). Les hélices sont numérotées. B- Zoom sur les ponts salins entre l’hélice α3 du domaine HTH et les hélices α8 et α9 du domaine TPR

La structure du complexe ternaire ComR/XIP/ADN (Code PDB : 5JUB) montre la formation d’un dimère asymétrique caractérisé par un linker flexible reliant les domaines HTH et TPR (Figure 33). Les domaines HTH, libérés, interagissent en dimère avec l’ADN cible, via leurs hélices α3 qui se positionnent alors dans le grand sillon des deux demi-sites de la ComR-box.

Figure 33 : Structure du complexe ternaire ComRSth/XIPSth/ADN (Code PDB : 5JUB) (TALAGAS et al. 2016)

A- Une sous unité est colorée en gradient de couleur du bleu au violet. L’autre est en gris. Chaque brin d’ADN

est également coloré du bleu (5’) au rouge (3’). B- Zoom sur l’interaction entre le dimère de domaines HTH et la séquence d’ADN indiquée au-dessus.

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Une analyse par SEC-MALS ayant montré que le complexe binaire ComR-XIP était dimérique en solution, un mécanisme d’activation avait alors été proposé (Figure 34), suggérant que la fixation du peptide faisait passer la superhélice TPR de ComR d’une conformation ouverte à une conformation plus compacte, induisant le relargage du domaine HTH et la dimérisation des domaines TPR (Figure 35). Cependant, le complexe ComR/XIP n’a jamais été cristallisé chez S. thermophilus et l’on ne sait pas si une conformation monomérique avec le domaine HTH libre peut exister ou non.

Figure 34 : Mécanisme d’activation proposé pour le système ComRS de S. thermophilus

L’hélice α9 est représentée en jaune. Les points rouges représentent les résidus impliqués dans la séquestration du HTH et les points bleus ceux impliqués dans la dimérisation des domaines TPR.

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Figure 35 : Zoom sur la zone de dimérisation dans le complexe ComRSth/XIP/ADN (Code PDB : 5JUF). 4 résidus de chaque chaine, représentés en sticks et colorés par éléments, permettent de former 4 ponts salins qui

stabilisent la conformation dimérique de la protéine. Les domaines TPR de ComR sont représentés en ruban colorés par chaine, en vert et gris. Les peptides sont représentés en stick noir et rose

Afin d’aller plus loin dans la compréhension du rôle de chaque résidu formant le peptide XIP, une étude fonctionnelle basée sur un Ala-scan de la séquence de l’octapeptide XIPSth

(LPYFAGCL) de S. thermophilus a été réalisée. Cette dernière montre que les variants XIP- Y3A (LPAFAGCL), XIP-F4A (LPYAAGCL) et XIP-L8A (LPYFAGCA) n’activent pas la protéine ComRSth(FONTAINE et al. 2013) (Figure 36).

Figure 36 : Activité relative sur ComRSth de 8 variants XIP.

Chacun porte la mutation en alanine d’un résidu du peptide sauvage XIPSth (LPYFAGCL) (à l’exception du résidu XIP-A5 qui a été substitué par une glycine) (FONTAINE et al. 2013)

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Des mesures d’interaction par ITC ont ensuite montré que l’inactivité des variants F4A et L8A étaient due à une forte baisse d’affinité, avec des KD de l’ordre du micromolaire. Par contre, le

variant Y3A se fixe sur la protéine ComRSth avec un KD du même ordre de grandeur que le

peptide natif (KD = 32.6 +/- 5.4 nM pour XIPSth-Y3A contre 10.0 +/- 1 nM pour le peptide natif)

(Figure 37) (TALAGAS et al. 2016). Ce résultat suggère donc que le résidu XIPSth-Y3A, joue un

rôle essentiel dans le mécanisme d’activation mais pas dans la fixation du peptide.

Figure 37 : Comparaison des affinités des peptides XIPSth et XIPSth-Y3A.

Isothermes des interaction ComRSth / XIPSth (LPYFAGCL, panneau de gauche) et ComRSth / XIPSth-Y3A (LPAFAGCL, panneau de droite). La protéine est à 40µM et le peptide est présent 10 fois en excès dans les deux

mesures.

Enfin, une étude de cross-talk menée sur les systèmes ComRS de type II (S. mutans, S. pyogenes et S. bovis) et de type III (S. suis) a permis de mettre en évidence des différences de permissivité d’une espèce à l’autre (SHANKER et al. 2016) (Figure 38). Le récepteur ComR de S. suis est

activé uniquement par son peptide XIP (WGTWVEE) tout comme S. mutans par son peptide natif XIP (GLDWWSL). Ces protéines ne semblent avoir aucune permissivité alors que ComR de S. bovis, dont le peptide natif a pour séquence (LTAWWGL) est également activé par le

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peptide de S. mutans (GLDWWSL) et, à moindre mesure par ceux de S. pyogenes (SAVDWWRL) et S. suis (WGTWVEE), ce qui montre une forte permissivité.

Figure 38 : Analyse de la permissivité des systèmes ComRS de type II

Profil d’activité de ComR en présence de différents peptides XIP chez 4 espèces différentes. Un gène codant pour la luciférase a été mis sous la régulation de la protéine ComR. Des peptides XIP de différentes tailles provenant d’espèces identiques et hétérologues ont été ajouté à des concentrations croissantes pour chaque protéine. La mesure de l’activité de luminescence pour chaque essai est normalisée sur la valeur de

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