Synthèse et discussion

5.1.2.1 Análise do potencial de membrana mitocondrial (Δψm)

Considerando que a redução do ΔΨm sugere a ativação da glicólise aeróbica (“efeito Warburg”) como via alternativa de obtenção de energia, o potencial de membrana mitocondrial das diferentes linhagens celulares foi avaliado empregando a sonda comercial MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen, Carlsbad, EUA).

Diversas moléculas têm sido empregadas como indicadoras de ΔΨm (SCADUTO; GROTYOHANN, 1999). Tais sondas são cátions lipofílicos que se distribuem na matriz mitocondrial e no espaço intermembrana (SCADUTO; GROTYOHANN, 1999). Dentre as sondas disponíveis encontram-se: a saframina (AKERMAN; WIKSTRIJM, 1976; VALLE; PEREIRA-DA-SILVA; VERCESI, 1986), o JC-1, a DiOC6 e a rodamina 123 (LY; GRUBB; LAWEN, 2003; SCADUTO;

GROTYOHANN, 1999). Embora estas sondas tenham sido amplamente empregadas, elas apresentam alguns problemas metodológicos (VALLE; PEREIRA- DA-SILVA; VERCESI, 1986). Isto porque, o influxo destas moléculas depende do co- transporte de diferentes íons, como Ca2+ _{ou K}+ _{(VALLE; PEREIRA-DA-SILVA;}

VERCESI, 1986). Desta forma, estas sondas avaliam o ΔΨm dependente do co- transporte iônico (VALLE; PEREIRA-DA-SILVA; VERCESI, 1986). Por esta razão, este estudo avaliou o ΔΨm por meio de imunofluorescência e citometris de fluxo, empregando a sonda MitoTracker Deep Red FM, a qual permite avaliar o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) de forma independente do transporte de íons.

Imunofluorescência indireta: Um total de 5 x 103 _{células das respectivas}

linhagens, na terceira passagem (P3) foi transferido por poço, em uma placa de seis poços, contendo uma lamínula de 24 X 24 mm estéril e 2,0 mL de meio completo. A

passagem P3 foi escolhida a fim de evitar resultados falso-positvos decorrentes da possível influência da manipulação celular. O material foi incubado por 24 horas a 37 °C com 5% de saturação de CO2. Após este período, 1 mM da sonda MitoTracker

Deep Red FM (Invitrogen, Carlsbad, EUA), diluída em DMSO, foi adicionado. O material foi incubado por 40 minutos a 37 ºC. O meio foi removido com auxílio de pipeta de Pasteur estéril. As células foram lavadas por cinco minutos com PBS estéril, tendo sido realizadas duas lavagens. As células foram fixadas em formaldeído tamponado a 4% a 4 °C por 30 minutos. O material foi lavado por duas vezes com PBS e as lamínulas foram montadas sobre lâminas empregando 20 µL de ProLong Gold contendo DAPI (Invitrogen, Carlsbad, EUA). O material foi analisado em microscópio de epifluorescência Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Alemanha) em aumento total de 400X.

Citometria de fluxo: Um total de 5 x 104 _{células das respectivas linhagens foi}

transferido para frascos de cultura de 25 cm2_{, contendo meio 4 mL de meio completo}

e incubado nas condições descritas na seção 5.1.1.1 até se obter uma confluência de 80%. Nesta confluência, 1 mM da sonda 1 mM da sonda MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen, Carlsbad, EUA), diluída em DMSO, foi adicionado por frasco. O material foi incubado por 40 minutos a 37 °C. Após este tempo, a monocamada foi desagregada conforme descrito na seção 5.1.1. As células foram homogeneizadas com 1,0 mL de PBS e centrifugadas a 300 g por cinco minutos, descartando-se o sobrenadante. O pellet foi homogeneizado com 200 µL de PBS, vortexado por cinco segundos e analisado no citômetro de fluxo BD Accuri C6 (BD Bioscience, EUA), empregando o filtro FL4. Os resultados foram analisados no software FlowJo, por meio de histogramas. As análises comparativas foram baseadas no percentual de células e mediana de fluorescência, conforme proposto por de-Sá-Júnior et al. (2016).

5.1.2.2 Análise da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)

Considerando que o aumento da produção das EROs leva ao estresse oxidativo, favorecendo a TEM (CICHON; RADISKY, 2014), os níveis de EROs foram avaliados por meio de CF. Tal análise foi realizada por meio do ensaio de diacetato de dicloro-diidro-fluoresceína (DCFH-DA), considerado o método mais recomendado para avaliar o estresse oxidativo (ARANDA et al., 2013), devido sua alta sensibilidade de detecção de EROs (FERREIRA et al., 2014; RASTOGI et al., 2010).

Isto porque, na presença de radicais livres, o DCFH-DA é oxidado a 2,7- diclorofluorescepina (DCFH) (figura 21), que apresenta autofluorescência.

Figura 21 - Conversão do DCFH-DA a DCFH na presença de radicais livres

Oxidação do DCFH-DA na presença de espécies reativas de oxigênio, resultando na formação do DCFH, cujo produto apresenta fluorescência. Fonte: Gomes, Fernandes, Lima (2005).

As diferentes linhagens celulares, na terceira passagem (P3), foram subcultivadas em frascos de cultura de 25 cm2_{, contendo 2,0 mL de meio completo}

até se obter uma confluência de 80%. Um volume de 80 μL da sonda DCFH-DA foi adicionado por frasco de cultura. O material foi incubado por 40 minutos a 37 ºC, conforme proposto por Aranda et al. (2013). Após este período, o meio foi removido e a monocamada foi submetida a desagregação não enzimática, conforme seção 5.1.1.1. As células foram homogeneizadas com 200 μL de PBS e analisadas no citômetro BD Accuri C6 (BD Bioscience, EUA), empregando o canal FL1. Os resultados foram analisados por meio de histogramas baseados no percentual de células e na mediana de fluorescência, conforme proposto por de-Sá-Júnior et al. (2016).

Como controle positico, foi empregado o peróxido de hidrogênio (100 μM), cuja concentração de uso foi determinada pelo ensaio colorimétrico do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio). Em detalhes: Um total de 5 X 104 _{células de pele saudável foi transferido para placas de 96 poços, contendo 200}

μL de meio completo por poço. O material foi incubado por 24 horas a 37 ºC, com diluições seriadas de 200-0 μM de peróxido de hidrogênio. O meio foi removido e as células, lavadas com 200 μL de PBS a 37 ºC. Um volume de 100 μL da solução de MTT (0,5 mg/mL) foi adicionado por poço, permanecendo incubado por seis horas a 37 ºC. A solução de MTT foi removida e um volume de 100 μL de DMSO foi adicionado por poço. A placa foi incubada por cinco minutos sob mesa agitadora.

Após esta etapa, o material permaneceu cinco minutos sem agitação para a estabilização. As leituras foram realizadas no leitor de ELISA Multiskan EX (Thermo Scientific, EUA), em comprimento de onda de 540 nm. As análises estatísticas foram realizadas por meio do software BioEstat versão 5.0 (AYRES et al., 2007). O ensaio foi realizado em triplicata, tendo como controle apenas a linhagem de pele saudável, na ausência do peróxido de hidrogênio.