As sequências parciais do gene mitocondrial citocromo c oxidase I (COI) foram obtidas através de extração de DNA de células musculares e do fígado de 5 indivíduos de cada espécie, através do método CTAB, de acordo com Doyle e Doyle (1990). A amplificação da sequência foi realizada através de PCR em ciclador térmico, com os primers Fish F1 e Fish R1 (WARD et al., 2005).
Os segmentos de DNA amplificados foram visualizados em gel de agarose à 1% e purificados com kit de purificação GE Healthcare GCF PCR DNA, seguindo as orientações do fabricante e sequenciados em equipamento ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems) por empresa terceirizada. As sequências individuais foram tratadas no software
Geneious 4.8.5 e identificadas contra o banco de dados do Nacional Center for Biotechnology
Information - NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
As análises de distância genética intraespecífica e interespecífica foram realizadas no
software MEGA 6.06 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), no qual as sequencias
foram alinhadas pelo algoritmo Muscle, comparadas e posteriormente foi elaborado um dendograma com base na distância genética (KUMAR; GADAGKAR, 2000), a qual foi calculada utilizando o modelo Kimura-2-parâmetros (K2P) (KIMURA, 1980).
Para enraizamento do dendograma foi incluída a espécie A. scabripinnis, da qual A.
parte do complexo de A. scabripinnis e A. fasciatus, que forma outro complexo de espécies dentro deste gênero. O método utilizado para construção do dendograma foi de Neighbor- Joining (SAITOU; NEI, 1987). Como técnica de estimação de erros estatísticos, utilizou-se a análise de bootstrap, com 1.000 replicações, o qual é utilizado para medir o grau de suporte dos nós pelo alinhamento das sequências. O valor de bootstrap representa o número de vezes que o agrupamento ocorreu nas replicações. Estas análises estão integradas no software Mega 6.06, utilizado também para a construção do dendograma.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados estão organizados em um capítulo, correspondente ao artigo científico:
CAPÍTULO 1
Análise morfológica, citogenética e de genética molecular: um caso de sinonímia no gênero Astyanax (CHARACIFORMES: CHARACIDAE)
4.1 CAPÍTULO 1
Análise morfológica, citogenética e de genética molecular: um caso de sinonímia no gênero Astyanax (CHARACIFORMES: CHARACIDAE)
RESUMO
O gênero Astyanax, considerado como Incertae sedis na Família Characidae, caracteriza-se pela ausência de monofiletismo e um elevado número de espécies. O objetivo desta pesquisa foi verificar se A. serratus, considerada endêmica da bacia do Rio Iguaçu e A. laticeps, distribuída nas bacias costeiras, constituem uma única espécie em sinonímia, ou apresentam um nível de variabilidade suficiente para distinção como espécies crípticas, uma vez que apresentam grandes semelhanças morfológicas. Foram realizadas análises integradas sob os aspectos da morfologia, incluindo medições da proporção corporal em relação ao comprimento da cabeça e do corpo, contagens de escamas, raios de nadadeiras, dentes e número de cúspides; análise citogenética, por meio de bandamento C, detecção de Ag-RONs por impregnação com nitrato de prata, citogenética molecular, com localização de sítios de DNA ribossomal 5S e 18S através de técnica de hibridação in situ fluorescente e de genética molecular, incluindo sequenciamento parcial do gene citocromo c oxidase I (COI) e utilização como DNA barcode. Ambas as espécies apresentaram pré-maxilar com duas séries de dentes, sendo a série externa com dentes tricuspidados, e dentes da série interna com 3 a 5 cúspides, presença de ganchos nas nadadeiras pélvicas e anal de machos, corpo alongado, com uma mancha umeral com estreito prolongamento anteroventral. As duas espécies apresentaram 2n = 50 cromossomos, fórmula cariotípica composta por 4m + 24sm + 6st + 16a e número fundamental de 84. O padrão de localização de heterocromatina e Ag-RONs mostrou-se heterogêneo entre as duas espécies, com variações intrapopulacionais nos sítios heterocromáticos. A utilização de marcadores cromossômicos revelou localização dos sítios de rDNA 5S no par cromossômico 19 em ambas as espécies, com heterogeneidade nas marcações de rDNA 18S. O sequenciamento do gene mitocondrial COI foi determinante nesta análise, pois revelou uma baixa divergência genética interespecífica, de apenas 0,2%. Estes diferentes níveis de análise sugerem que A. serratus e A. laticeps são espécies sinônimas, ampliando a ocorrência de A. laticeps na bacia do rio Iguaçu e reforçando a hipótese de compartilhamento de fauna através do escudo cristalino. As variações interespecíficas encontradas no mapeamento de heterocromatina constitutiva, Ag-RONS e rDNA 18S são comuns em Astyanax e derivam de eventos não robertsonianos, mas também podem sugerir um processo de vicariância, com o isolamento geográfico das bacias hidrográficas e restrição de fluxo gênico entre a população do rio Iguaçu e populações de tributários litorâneos. A utilização do barcode através do sequenciamento do COI se mostrou eficiente na resolução de problemas taxonômicos neste caso.
Morphological analyses, cytogenetics and molecular genetics: a case of synonyms in the genus Astyanax (CHARACIFORMES: CHARACIDAE)
ABSTRACT
The genus Astyanax considered as Incertae sedis in the Characidae family is characterized by absence of monophyly and a high number of species. The objective of this study was to verify whether A. serratus, considered endemic of the Iguaçu River basin and A. laticeps, distributed in coastal basins, constitute a single species in synonym, or present a sufficient variability for distinction as cryptic species, since they are showing great morphological similarities. Integrated analyzes were conducted under aspects of morphology, including measurements of body proportion to length of the head and body; counting scales; fin rays; teeth and number of cusps; cytogenetic analysis by C-banding, Ag-NORs detection by impregnation with silver nitrate, location DNA ribosomal sites 5S and 18S through fluorescent in situ hybridization technique and molecular genetics, including the sequencing partial of cytochrome c oxidase I gene (COI) and the use as DNA barcode. The two species have pre-jaw with two series of teeth, where the external series with tricuspid teeth, and the teeth of internal series with 3-5 cusps, presence of hooks on anal and pelvic fins of males, elongated body with a humeral spot with narrow anteroventral extension. Both species presented 2n = 50 chromosomes, karyotype formula consisting of 4m + 24sm + 6st + 16th and fundamental number of 84. The pattern of location of heterochromatin and Ag-NORs showed heterogeneous between the two species, with intrapopulational variations. The use of chromosomal markers revealed location DNA ribosomal sites 5S and 18S in the chromosome 19 pair in both species, with heterogeneity in the markings of 18S rDNA. The sequencing of the mitochondrial gene COI, was determining factor in this analysis, because revealed a low interspecific genetic divergence of only 0.2%. These different levels of analysis suggest that A. serratus and A. laticeps are synonymous species, increasing the occurrence of A. laticeps in the Iguaçu River basin and reinforcing the hypothesis of fauna sharing through the crystalline shield. The interspecifc variations found in the mapping of constitutive heterochromatin, Ag-NORs and 18S rDNA are common in
Astyanax and derived of events no robertsonian, whereas the differences can also to suggest a vicariant process, with geographic isolation of watersheds and gene flow restriction between the populations of the Iguaçu River and populations of coastal tributaries. The barcode use through the COI sequencing proved effective in solving taxonomic problems in this case.
Introdução
Os peixes da Ordem Characiforme possuem uma ampla distribuição geográfica, compreendendo a África do Sul e continente Americano (MALABARBA et al., 2013), destacando-se também entre a ictiofauna Neotropical pelo elevado número de espécies, correspondendo a 3.381 espécies válidas (REIS; KULLANDER; FERRARIS, 2003; ESCHMEYER; FONG, 2015).
A Família Characidae é amplamente distribuída e apresenta o maior número de espécies na região Neotropical (MIRANDE, 2009; 2010), com um total de 2.182 espécies válidas (MIRANDE, 2009; ESCHMEYER; FONG, 2015). O elevado número de espécies e a ausência de sinapomorfias para a determinação de subfamílias monofiléticas fez com que 92 de 170 de seus gêneros fossem considerados como Incertae Sedis, como, por exemplo,
Astyanax, Bryconamericus e Hyphessobrycon (REIS; KULLANDER; FERRARIS, 2003;
MIRANDE, 2009; BAUMGARTNER et al., 2012).
Composto por 155 espécies válidas (ESCHMEYER; FONG, 2015) e com ampla distribuição na região Neotropical, com destaque nas bacias da América do Sul, os Astyanax são popularmente conhecidos como “lambaris” (MALABARBA et al., 2013). Este gênero foi inicialmente descrito por Baird e Girard (1854), e Reis; Kullander e Ferraris (2003), o agrupou como Incertae Sedis na Família Characidae, devido a ausência de evidências de monofiletismo. Caracterizam-se pela presença de nadadeira adiposa, duas fileiras de dentes no pré-maxilar, com cinco dentes na série interna; linha lateral completa e nadadeira caudal sem escamas (EIGENMANN, 1921; 1927).
A citogenética deste gênero mostra um número diploide que varia desde 36 cromossomos em A. schubartti (MORELLI et al, 1983; DANIEL SILVA; ALMEIDA- TOLEDO, 2001; 2005) até 50 cromossomos para a maioria das espécies, como, por exemplo,
A. altiparanae, A. eigenmanniorum, A. janeiroensis, A. mexicanus, A. scabripinnis, A. bifasciatus e A. minor (FAUAZ; VICENTE; MOREIRA-FILHO, 1994; MAISTRO, et al.,
1994; CARVALHO; OLIVEIRA; FORESTI, 2002; DOMINGUES et al., 2007; KAVALCO; ALMEIDA-TOLEDO, 2007; PAZZA, 2007), não havendo cromossomos sexuais morfologicamente diferenciados (MORELLI et al., 1983).
Astyanax laticeps foi descrito inicialmente por Cope (1894), como Tetragonopterus laticeps. Eingemann (1910; 1921) o incluiu como uma subespécie de A. scabripinnis e, em
2001, foi reconhecido como uma espécie válida, denominada Astyanax laticeps (BERTACO; MALABARBA, 2001; REIS; KULLANDER; FERRARIS, 2003).
A ocorrência de A. laticeps foi registrada em drenagens costeiras do Uruguai e do sul do Brasil, na bacia do rio Uruguai (AZPELICUETA; LOUREIRO, 2009; BERTACO; LUCENA, 2010) e também na bacia Atlântica do Paraná e do Rio Ribeira de Iguape, na qual era identificada anteriormente como Astyanax janeiroensis (OLIVEIRA, 2011b).
Astyanax sp. D, foi citada inicialmente por Sampaio (1988) e diagnosticada por
Garavello e Sampaio (2010), como Astyanax serratus. Considerada endêmica da bacia do rio Iguaçu, apresenta corpo com a região ventral mais clara, escurecendo em direção ao dorso; faixa longitudinal escura e larga, prateada quando em vida; mandíbula robusta, com a margem do terceiro infraorbital separada do pré-opérculo por uma área ampla de pele e boca terminal (BAUMGARTNER et al., 2012). Ingenito e Duboc (2014), baseados no estudo de Bertaco e Lucena (2006) mantiveram A. serratus, juntamente com A. laticeps dentro do complexo A.
scabripinnis.
Observações realizadas na morfologia de exemplares de A. laticeps e A. serratus por Oliveira (2011b) não revelaram diferenciação morfológica entre as espécies (Figura 3), indicando que podem ser espécies crípticas, ou A. serratus pode tratar-se, da espécie A.
laticeps, em sinonímia, ampliando a ocorrência de A. laticeps para a bacia do Rio Iguaçu,
hipótese reforçada pela ausência de comparação morfológica entre estas duas espécies na diagnose de A. serratus, realizada por Garavello e Sampaio (2010).
Neste sentido, faz-se necessário associar análises morfológicas, citogenéticas, envolvendo determinação de número diploide, caracterização da fórmula cariotípica e número fundamental, bem como o mapeamento de blocos de heterocromatina constitutiva, Ag-RONs e de DNA ribossomal, compreendendo as famílias de rDNA 18S e 5S, incluindo também o sequenciamento de DNA de regiões específicas, como o gene mitocondrial citocromo c oxidase I (COI), utilizado como DNA barcode, para uma análise integrada proporcionando uma visão sob diversos aspectos dos processos evolutivos envolvidos nestas duas espécies e compreender o padrão biogeográfico das mesmas.
O presente trabalho teve como objetivo determinar, por meio de homologias interespecíficas, se A. serratus é espécie sinônima ou críptica de A. laticeps e, além disso, avaliar se a distribuição geográfica desta pode ser ampliada para a bacia hidrográfica do Rio Iguaçu, permitindo a compreensão da relação taxonômica entre A. serratus e A. laticeps e gerando informações importantes para o entendimento do processo evolutivo do gênero
Astyanax, somando conhecimentos acerca da particular geomorfologia das bacias
Material e Métodos
Os indivíduos de ambas as espécies foram coletados na natureza (Tabela 1), de acordo com licença permanente para coleta de material zoológico (MMA/IBAMA/SISBIO: 15115- 1). Os procedimentos estão de acordo com o Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Ponta Grossa (Protocolo: 04509/08). Todos os indivíduos coletados foram identificados e depositados na coleção Ictiológica do Núcleo de Pesquisas de Limnologia, Ictiologia e Aquicultura (NUPÉLIA), da Universidade Estadual de Maringá (UEM), Paraná, Brasil.
Análise morfológica
Para a espécie Astyanax serratus foram realizadas medições em 20 indivíduos, correspondendo à 3 populações (Tabela 1): Rio Pintado (NUP 16890), Rio Correntes (NUP 16889) e Rio Claro (NUP 17529). Em Astyanax laticeps, foram realizadas medições em 14 indivíduos, correspondendo à 4 populações (Tabela 1): Riacho Itaiacoca (NUP 17533), Córrego Itapucu (NUP 17515), Rio Capivari (NUP 2869) e Rio Ribeirãozinho (NUP 5170). A localização dos pontos de coleta pode ser visualizada no mapa da Figura 4.
A análise morfométrica foi realizada utilizando-se de paquímetro digital, sendo consideradas as medidas proporcionais em relação ao comprimento da cabeça e ao comprimento do corpo. Foi realizada a contagem dos raios das nadadeiras anal, dorsal, peitoral e pélvica; do número de escamas da linha lateral, série de escamas acima e abaixo da linha lateral, da cabeça até o dorso (pré-dorsal) e circumpeduncular, de acordo com Fink e Weitzman (1974) e Menezes e Weitzman (1990). O comprimento padrão e o número de escamas acima e abaixo da linha lateral foram obtidos conforme Bertaco e Lucena (2006). Foi realizada análise das variáveis canônicas livres de tamanho das proporções obtidas, através do
software PAST v. 3.10, pelo algoritmo Legendre e Legendre (1998).
Foi realizada contagem de dentes das séries externa e interna do pré-maxilar, do dentário e do maxilar; número de cúspides dos dentes sinfisianos e não sinfisianos da série externa e interna do pré-maxilar, do dentário e do maxilar de acordo com Fink e Weitzman (1974). A extração dos dentes foi realizada seguindo a metodologia de Moreira-Filho e Garavello (1994). Os dentes foram posteriormente fotografados em microscópio de campo
claro (Olympus BX41) em aumento 40X acoplado a câmara CCD DP71 (Olympus) e o
software DP Controller (Olympus).
Citogenética convencional e molecular
Para o estudo citogenético e molecular foram utilizados 8 exemplares de A. serratus da população do Rio Pintado (NUP 16890) e 8 indivíduos de A. laticeps da população do Riacho Itaiacoca, bacia do rio Ribeira de Iguape.
A obtenção de cromossomos mitóticos foi realizada seguindo a técnica de preparações diretas de Bertollo; Takahashi e Moreira-Filho (1978). A detecção da heterocromatina constitutiva (bandas-C) ocorreu por meio da técnica de Sumner (1972), com alterações na coloração, realizada com iodeto de propídio (LUI et al., 2009). A caracterização das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs) foi realizada conforme Howell e Black (1980).
A hibridização in situ fluorescente (FISH) seguiu o protocolo de Pinkel; Straume e Gray (1986), realizada com sondas de DNA ribossômico 18S e 5S, obtidas respectivamente a partir do DNA genômico de Prochilodus argenteus (HATANAKA; GALETTI, 2004) e de
Leporinus elongatus (MARTINS; GALETTI, 1999).
As sondas foram marcadas com os kits Biotin Nick Translation e Dig Nick
Translation, segundo as recomendações do fabricante (Roche Applied Science). As reações de
hibridização tiveram a estringência de 77% (2,5 ng/μL sonda, 50 % formamida, 2 x SSC, 10% sulfato dextrano, à 37 °C por 16 horas). Para a detecção das sondas foram utilizados os anticorpos anti-digoxigenina conjugada com rodamina e streptavidina conjugada com FITC (Roche Applied Science). Os cromossomos foram contracorados com DAPI (0,2 μg/mL) em meio de montagem Vectashield.
As preparações cromossômicas convencionais e com hibridização in situ fluorescente foram analisadas em microscópio de campo claro e epifluorescência Zeiss Axio Imager A2 acoplado ao software ZEISS pro 2011 em Câmera Zeiss AxioCam MRm de Captura Monocromática com sensor CCD e resolução de 1.4 megapixels (Carl Zeiss®), foram analisadas no mínimo 30 metáfases para cada indivíduo, sendo utilizados quatro indivíduos machos e quatro fêmeas de cada espécie, para determinação do número diploide, fórmula cariotípica e número fundamental.
Os cariótipos foram montados usando o software Adobe Photoshop, versão CS6, a partir das melhores metáfases selecionadas. Os cromossomos foram classificados em
metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) de acordo com Levan; Fredga e Sandberg (1964). Os ideogramas foram construídos a partir dos cariótipos, e respectiva razão de braços (RB), com os softwares Easy Idio 1.0 (DINIZ; MELO, 2006) e Corel Drawv.X7, 2014 - Corel Corporation.
Obtenção e análise das sequências do gene citocromo c oxidase I (COI)
Para a obtenção das sequências do gene COI foi realizada a extração de DNA genômico e mitocondrial a partir de tecidos sólidos (fígado e músculo), utilizando o protocolo adaptado de Doyle e Doyle (1990), de 5 indivíduos de cada espécie, coletados no rio Pintado (A. serratus) e no riacho Itaiacoca (A. laticeps).
A amplificação da sequência foi realizada através de PCR em ciclador térmico, com os primers Fish F1 e Fish R1 (WARD et al., 2005), utilizando se de 2,5 µl de tampão 10x, 1,25 µl de MgCl2 (50 mM), 0,5 µl de mix de DNTPs (2 mM), 0,5 µl de cada primer (foword: 5’
TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 3’; reverse: 5’
TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 3’), 0,2 µL de Taq Polimerase (Invitrogen - 5 unidades), 2,5 uL de DNA concentrado à 10ng/µl, e completados para 25 µl com água Mili Q. O ciclo de PCR consiste em um passo inicial de desnaturação à 95ºC por 2 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturação à 94ºC por 30 segundos; anelamento à 46,1ºC por 30 segundos (para ambas as espécies) e extensão à 72ºC por 1 minuto, seguidos de um passo final de extensão à 72ºC por 10 minutos.
+ faz parte do complexo de A. scabripinnis e A. fasciatus, que forma outro complexo de espécies dentro deste gênero. Estas sequências foram obtidas através de depósitos na
plataforma Bold System
(http://www.boldsystems.org/index.php/Public_BINSearch?searchtype=records), conforme Figura 11.
Resultados
Astyanax laticeps apresentou comprimento padrão médio de 67,81 mm. Pré maxilar
com duas séries de dentes, sendo a série externa variando de 3 a 5 dentes. Tanto os dentes sinfisianos como os laterais se apresentaram tricuspidados (Figura 6: A, C). Série interna com 5 dentes, sendo os sinfisianos e os laterais variando de 5 a 3 cúspides (Figura 6: E, G). Maxilar variando de 0 a 2 dentes tricuspidados (Figura 6: M). Dentário com 4 dentes, os sinfisianos variando de 5 a 4 cúspides e os laterais apresentando de 5 a 3 cúspides (Figura 6: I, K). Todos os dentes apresentaram a cúspide central maior que as laterais.
Nadadeira dorsal com 2 raios ramificados e 8, 9 raios não ramificados. Nadadeira anal com 3, 4 raios ramificados e 16 a 23 raios não ramificados. Nadadeira peitoral com 1 raio ramificado e 11 a 12 raios ramificados e nadadeira pélvica com 1 raio ramificado e 6 a 7 raios não ramificados (Tabela 2).
Escamas ciclóides, linha lateral completa variando de 37 a 38 escamas perfuradas. Série de 6 a 8 escamas acima e 5 a 7 escamas abaixo da linha lateral. De 11 a 14 escamas pré- dorsais. Série longitudinal de 17 a 19 escamas ao redor do pedúnculo caudal (Tabela 2).
Astyanax serratus apresentou comprimento padrão médio de 74,05 mm. Pré maxilar
com duas séries de dentes, sendo a série externa variando de 3 a 4 dentes. Tanto os dentes sinfisianos como os laterais se apresentaram tricuspidados (Figura 6: B, D). Série interna com 5 dentes, sendo os sinfisianos e os laterais variando de 5 a 3 cúspides (Figura 6: F, H). Maxilar variando de 0 a 2 dentes com 3 a 1 cúspides (Figura 6: N). Dentário com 4 ou 5 dentes, tanto os sinfisianos como os laterais variando de 5 a 3 cúspides (Figura 6: J, L). Todos os dentes apresentaram a cúspide central maior que as laterais.
Nadadeira dorsal com 2, 3 raios ramificados e 8, 9 raios não ramificados. Nadadeira anal com 3, 4 raios ramificados e 16 a 19 raios não ramificados. Nadadeira peitoral com 1 raio ramificado e 11 a 13 raios ramificados e nadadeira pélvica com 1 raio ramificado e 7 raios não ramificados (Tabela 2).
Escamas ciclóides, linha lateral completa variando de 36 a 38 escamas perfuradas. Série de 6 a 7 escamas acima e 5 a 6 escamas abaixo da linha lateral. De 11 a 13 escamas pré- dorsais. Série longitudinal de 17 a 19 escamas ao redor do pedúnculo caudal (Tabela 2).
As proporções corporais obtidas através da morfometria constam na Tabela 3 e Figura 7.
As espécies estudadas apresentaram o mesmo número diploide, com 50 cromossomos, incluindo o primeiro par de cromossomos metacêntricos de grande porte em relação aos demais do complemento, mesma fórmula cariotípica, sendo 4 cromossomos metacêntricos; 24 submetacêntricos, 6 subtelocêntricos e 16 acrocêntricos (Figura 8) e mesmo número fundamental (84). Não foi constatada a presença de cromossomos sexuais morfologicamente diferenciados.
As regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs) se apresentaram múltiplas (Figura 8), sendo a maioria coincidentes com os sítios de rDNA 18S (Figura 9) em ambas as espécies. O bandamento C revelou regiões de heterocromatina constitutiva heterogêneas entre as espécies (Figura 9), sendo coincidentes com os sítios de rDNA 5S apenas em A. laticeps. Os sítios de heterocromatina localizaram-se em regiões centroméricas, com predominância em regiões teloméricas, sendo coincidentes com os sítios de Ag-RONS e com rDNA 18S nos pares 9 e 16 em A. laticeps. Em A. serratus, foi coincidente com as Ag-RONs e rDNA 18S nos pares 4, 7, 20 e 21. Em um dos cromossomos homólogos do par 4 de A. serratus foram evidenciados dois grandes blocos de heterocromatina, nas regiões teloméricas do braço curto e do braço longo. Foram evidenciados polimorfismos intrapopulacionais na localização de heterocromatina em ambas as espécies.
A técnica de hibridização in situ fluorescente revelou a presença do rDNA 5S na região centromérica do par cromossômico 19 em ambas as espécies (Figura 9). Os sítios de rDNA 18S apresentaram-se em ambos os homólogos no par 9 de A. laticeps e pares 4 e 7 de
A. serratus, além de constarem marcações heteromórficas nas duas espécies. Estes sítios
localizaram-se predominantemente em regiões teloméricas, com exceção para o par 21 de A.
serratus, onde localizou-se na região centromérica. Uma síntese dos marcadores
cromossômicos utilizados poder ser visualizada no ideograma (Figura 10).
Análise do Barcode
Através do sequenciamento do gene COI, foram evidenciados 686 pares de bases para este gene em ambas as espécies e as sequências obtidas foram de alta qualidade. As sequências foram depositadas no banco de dados do Nacional Center for Biotechnology
Information - NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) sob os registros: KX815347; KX815348; KX815349; KX815350 e KX815351 para A. laticeps e KX527840; KX527842; KX527843; KX527845 e KX527849 para A. serratus.
A divergência genética intraespecífica em A. serratus e A. laticeps foi de 0% para