Matériels et méthodes
9. La surexpression des SphKs et la S1P altèrent l’alignement des chromosomes
Nous avons démontré que la voie SphKs/S1P/S1P5 régule la durée de la prométaphase. Or, c’est au cours de cette phase que les chromosomes sont capturés et alignés par le fuseau mitotique en une plaque métaphasique. Il est bien établi que la durée de la prométaphase est étroitement associée à la qualité de ces événements, notamment via l’activité du SAC. Nous nous sommes donc intéressés aux conséquences d’un traitement par la S1P ou de la surexpression des SphKs sur l’alignement des chromosomes.
Pour cela, nous avons synchronisé des cellules HeLa ou RPE1 à la transition G2/M à l’aide du RO3306 puis réalisé un relargage en mitose en présence ou non de S1P de façon à analyser la qualité de l’alignement des chromosomes juste avant l’entrée en anaphase. Pour cela, les cellules ont été relarguées pendant 60 min. Suite au relargage, les cellules ont été fixées et des marquages par immunofluorescence des microtubules (α-tubuline), des kinétochores (CREST) et des chromosomes (DAPI) ont permis de sélectionner les cellules et d’analyser la qualité de l’alignement des chromosomes. Nous avons comptabilisé uniquement les cellules présentant un fuseau mitotique et une plaque métaphasique matures, de façon à s’affranchir des cellules en début de prométaphase n’ayant pas encore aligné leurs chromosomes. Nous avons considéré qu’une cellule présente des défauts d’alignement de ses chromosomes lorsqu’au moins l’un d’entre eux était retrouvé hors de la plaque (Figure 35A, flèches). Des images représentatives de l’alignement chromosomique dans des cellules HeLa contrôles (DMSO) ou traitées par la S1P sont montrées dans la figure 35A. Alors qu’une faible proportion de cellules HeLa contrôles (DMSO) présentent des défauts d’alignement chromosomique (13,9 ± 0,8 %), ce pourcentage est significativement augmenté dans les cellules traitées par la S1P (24,8 ± 0,9 %) (Figure 35B). Ces résultats ont été reproduits dans la lignée RPE1 où le taux de cellules présentant des défauts d’alignement passe de 11,8 ± 0,7 % pour la condition contrôle (DMSO) à 41,9 ± 0,3 % pour la population traitée à la S1P (Figure 35C). Ceci indique donc que le traitement par la S1P altère la qualité de l’alignement des chromosomes.
Etant donné que les populations contrôle et traitée par la S1P ne progressent pas à la même vitesse dans la mitose (Figure 27), il est possible que cela impacte la qualité de l’alignement chromosomique. Nous avons imaginé une expérience pour déterminer si la durée de la prométaphase est un facteur important pour l’alignement chromosomique. En effet, il est intéressant de savoir si de forts taux d’erreurs d’alignement des chromosomes observés notamment en présence de S1P sont corrigés si la durée de la prométaphase est allongée. Pour cela, nous avons synchronisé des cellules HeLa en G2/M comme précédemment à l’aide d’un traitement par le RO3306 puis les avons relarguées en présence d’un inhibiteur du protéasome, le MG132. L’utilisation de ce composé en mitose bloque la dégradation de nombreux régulateurs comme la cycline B1 ou la sécurine même lorsque le SAC est résolu, empêchant ainsi l’entrée en anaphase et rallongeant la durée de la prométaphase et de la métaphase (Potapova et al., 2006). Nous avons donc effectué des cinétiques de relargage en présence de MG132 et déterminé comme précédemment la qualité de l’alignement chromosomique dans des cellules contrôles (DMSO) ou traitées à la S1P. Après 60 min de relargage, la population HeLa contrôle comporte un taux modéré de cellules présentant des défauts d’alignement (18,2 ± 1,9 %). Avec le temps, ce pourcentage diminue et après 120 min, il est de 11,2 ± 2 % (Figure 35D). En revanche, et dès 60 min de relargage, la population traitée par la S1P présente un taux plus important de cellules avec des alignements chromosomiques incorrects (32,6 ± 1,4 %). De plus, de façon surprenante, on retrouve une proportion similaire après 120 min de relargage (32,4 ± 0,9 %) (Figure 35D). Ces résultats indiquent donc que la proportion d’erreurs d’alignement induite par la S1P persiste tout au long de la prométaphase et de la métaphase. Ceci peut provenir d’une correction défaillante de ces erreurs ou de la génération constante d’alignements incorrects.
Par vidéomicroscopie, nous avons également vérifié que le traitement par le MG132 bloquait bien les cellules en métaphase. Nos résultats indiquent que l’efficacité du MG132 pour induire l’arrêt des cellules HeLa contrôles ou traitées à la S1P est comparable et maximale dans nos conditions (Figure 35E). Nous n’avons observé aucune cellule entrant en anaphase. En parallèle, nous avons mesuré le taux de cycline B1 dans des cellules HeLa traitées par le MG132 en présence ou non de S1P de façon similaire à l’expérience décrite dans la figure 35D. Les taux de cycline B1 sont stables dans les deux conditions au cours du temps, indiquant que les cellules ne franchissent pas la métaphase (Figure 35F). L’expression comparable dans les deux conditions de l’H3S10P confirme la présence de cellules en mitose dans des proportions similaires.
Figure 35. La surexpression des SphKs et la S1P altèrent l’alignement des chromosomes.
(A) Images représentatives de la qualité de l’alignement des chromosomes dans des cellules HeLa contrôles (DMSO) ou traitées par la S1P. Les microtubules sont marqués par l’α-tubuline (vert), l’ADN par le DAPI (bleu) et les kinétochores par le CREST (rouge). Les flèches indiquent des chromosomes mal alignés. Barre d’échelle : 10 µm.
(B) et (C) Quantification du pourcentage de cellules HeLa (B) et RPE1 (C) en mitose présentant des défauts d’alignement. Les cellules ont été synchronisées à la transition G2/M à l’aide du RO3306 puis relarguées en mitose en présence ou non de S1P (5 µM). Les histogrammes représentent les moyennes ± SEM de cinq expériences indépendantes (B : DMSO, n = 958 ; S1P, n = 971 — C : DMSO, n = 1017 ; S1P, n = 1002). ***, p<0,001 (test de Student).
(D) Quantification du pourcentage de cellules HeLa en mitose présentant des défauts d’alignement au cours du temps en présence de MG132. Les cellules ont été synchronisées par un traitement au RO3306 (10 µM, 16h) puis relarguées en mitose pendant les temps indiqués en présence de MG132 (2 µM) ± S1P (5 µM). Les histogrammes représentent les moyennes ± SEM de deux expériences indépendantes (DMSO, n = 119 ; S1P, n = 94). ***, p<0,001 (test de Student).
(E) Quantification de l’arrêt des cellules en présence de MG132 par vidéomicroscopie. Les cellules ont été traitées par 2 µM de MG132 ± 5 µM de S1P et filmées pendant 12h. Le pourcentage de cellules arrêtées en métaphase, franchissant la métaphase ou mourant en mitose a été déterminé. Les histogrammes représentent les moyennes ± SEM de deux expériences indépendantes (DMSO, n = 85 ; S1P, n = 42).
(F) Les cellules HeLa ont été synchronisées à la transition G2/M par le RO3306 puis relarguées en mitose pendant les temps indiqués (min) en présence de MG132 (2 µM) ± S1P (5 µM). L’expression de la cycline B1 et de l’H3S10P ont été évaluées par Western blot. Le résultat d’une expérience représentative parmi trois indépendantes est représenté.
(G) Quantification du pourcentage de cellules HeLa en mitose surexprimant les GFP-SphKs présentant des défauts d’alignement. Les cellules ont été transfectées pendant 48h avant d’être synchronisées et relarguées en mitose pendant 60 min en présence de MG132 (2 µM). Seules les cellules GFP positives ont été évaluées. Les histogrammes représentent les moyennes ± SEM de deux expériences indépendantes (GFP, n = 224 ; GFP-SphK1, n = 198 ; GFP-SphK2, n = 206). *, p<0,05 ; **, p<0,01 (ANOVA).
Enfin, nous nous sommes intéressés à l’effet de la surexpression transitoire des SphKs sur la qualité de l’alignement chromosomique. De façon similaire aux expériences réalisées précédemment, nous avons synchronisé des cellules HeLa surexprimant la GFP seule ou les GFP-SphKs à la transition G2/M puis les avons relarguées en mitose et réalisé des expériences d’immunofluorescence pour analyser l’alignement des chromosomes. Seules les cellules positives pour la GFP et en métaphase ont été analysées. De façon similaire au traitement par de la S1P exogène, la surexpression de la GFP-SphK1 ou de la GFP-SphK2 induisent une augmentation significative du pourcentage de cellules présentant des défauts d’alignement chromosomique par rapport à la condition contrôle (40,4 ± 4,6 % et 46,4 ± 5,7 % versus 18,5 ± 1,6 % respectivement) (Figure 35G).
L’ensemble de ces résultats démontre que la surexpression des SphKs et la stimulation par la S1P altère la qualité de l’alignement des chromosomes en métaphase. Or, la persistance de telles erreurs peut altérer la ségrégation des chromosomes entre les deux cellules filles.