2.3.1. Dosagem Sérica de Cortisol
2.3.1.1. Bases do método
A determinação dos níveis séricos de cortisol, foi feita utilizando-se o método de radioimunoensaio (GARCIA et al, 2000) a partir da utilização de Kit Coat-A-Count® Cortisol, DPC (EUA). A atividade específica do Kit foi de 204 Kilobecquerels (kBq).
O radioimunoensaio (RIE) é um método competitivo de fase sólida, que se baseia na reação imunológica de ligação antígeno-anticorpo, onde o hormônio não marcado a ser dosado e o padrão compete com o traçador (125I-Cortisol) para um
número limitado de sítios de ligação do anticorpo fixados covalentemente na parede interna de tubos de polipropileno. Na fase final do método, os antígenos livres foram decantados, permanecendo no tubo apenas os ligados aos anticorpos citados. A contagem do número de pulsos por minuto no tubo de polipropileno, ou seja, a emissão de radiação gama do 125I-Cortisol, foi realizada em contador de cintilação gama, DPC gambyt CR, do Departamento de Biofísica da UFPE.
Nesta reação de competição, quanto maior a concentração de hormônio livre da amostra, menor a ligação do 125I-Cortisol ao anticorpo específico com conseqüente redução na formação do complexo radioativo. Com base nesta proporção inversa, foi calculado o 125I-Cortisol-anticorpo e assim, dosado o hormônio não marcado através da
construção de uma curva-padrão, empregando-se quantidades crescentes do hormônio padrão de cortisol.
2.3.1.2. Procedimento metodológico
Todas as dosagens foram feitas em duplicatas. Primeiramente, foram colocados com pipeta automática, 25µl das soluções padrão e 25µl de soro a ser dosado, nos tubos previamente identificados. Após esta etapa, foi colocado 1ml do 125I-Cortisol em cada tubo os quais foram agitados por aproximadamente 5 segundos. Em seguida os soros foram colocados em banho-maria a 37ºC por 45 minutos. Após o tempo determinado, o líquido dos tubos foi desprezado e a contagem foi feita.
2.3.2. Dosagem Sérica de Insulina
A determinação dos níveis séricos de insulina, foi feita utilizando-se o método de radioimunoensaio a partir da utilização de Kit Coat-A-Count® Insulin, DPC (EUA). A atividade específica do Kit foi de 111 Kilobecquerels (kBq).
O radioimunoensaio (RIE) é um método competitivo de fase sólida, que se baseia na reação imunológica de ligação antígeno-anticorpo, onde o hormônio não marcado a ser dosado e o padrão compete com o traçador (125I-Insulin) para um número limitado de sítios de ligação do anticorpo fixados covalentemente na parede interna de tubos de polipropileno. Na fase final do método, os antígenos livres foram decantados, permanecendo no tubo apenas os ligados aos anticorpos citados. A contagem do número de pulsos por minuto no tubo de polipropileno, ou seja, a emissão de radiação gama do
125I-Cortisol, foi realizada em contador de cintilação gama, DPC gambyt CR, do
Departamento de Biofísica da UFPE.
Nesta reação de competição, quanto maior a concentração de hormônio livre da amostra, menor a ligação do 125I-Insulin ao anticorpo específico com conseqüente
redução na formação do complexo radioativo. Com base nesta proporção inversa, foi calculado o 125I-Insulin-anticorpo e assim, dosado o hormônio não marcado através da construção de uma curva-padrão, empregando-se quantidades crescentes do hormônio padrão de cortisol.
2.3.2.2. Procedimento metodológico
Todas as dosagens foram feitas em duplicatas. Primeiramente, foram colocados com pipeta automática, 200µl das soluções padrão e 200µl de soro a ser dosado, nos tubos previamente identificados. Após esta etapa, foi colocado 1ml do 125I-Insulin em
cada tubo os quais foram agitados por aproximadamente 5 segundos. Em seguida os tubos foram incubados por três horas a temperatura ambiente. Após o tempo determinado, o líquido dos tubos foi desprezado e a contagem foi feita.
2.3.3. Dosagem Sérica de T3
2.3.3.1. Bases do método
A determinação dos níveis séricos de T3, foi feita utilizando-se o método de
radioimunoensaio a partir da utilização de Kit Coat-A-Count® T
3, DPC (EUA). A
atividade específica do Kit foi de 130 Kilobecquerels (kBq).
O radioimunoensaio (RIE) é um método competitivo de fase sólida, que se baseia na reação imunológica de ligação antígeno-anticorpo, onde o hormônio não marcado a ser dosado e o padrão compete com o traçador (125I- T3) para um número
limitado de sítios de ligação do anticorpo fixados covalentemente na parede interna de tubos de polipropileno. Na fase final do método, os antígenos livres foram decantados, permanecendo no tubo apenas os ligados aos anticorpos citados. A contagem do número de pulsos por minuto no tubo de polipropileno, ou seja, a emissão de radiação gama do
125I- T
3, foi realizada em contador de cintilação gama, DPC gambyt CR, do
Departamento de Biofísica da UFPE.
Nesta reação de competição, quanto maior a concentração de hormônio livre da amostra, menor a ligação do 125I- T3 ao anticorpo específico com conseqüente redução
na formação do complexo radioativo. Com base nesta proporção inversa, foi calculado o
125I- T
uma curva-padrão, empregando-se quantidades crescentes do hormônio padrão de cortisol.
2.3.3.2. Procedimento metodológico
Todas as dosagens foram feitas em duplicatas. Primeiramente, foram colocados com pipeta automática, 100µl das soluções padrão e 100µl de soro a ser dosado, nos tubos previamente identificados. Após esta etapa, foi colocado 1ml do 125I- T3 em cada
tubo os quais foram agitados por aproximadamente 5 segundos. Em seguida os soros foram colocados em banho-maria a 37ºC por 2 horas. Após o tempo determinado, o líquido dos tubos foi desprezado e a contagem foi feita.
2.3.4. Dosagem Sérica de T4
2.3.4.1. Bases do método
A determinação dos níveis séricos de T4, foi feita utilizando-se o método de
radioimunoensaio a partir da utilização de Kit Coat-A-Count® T4, DPC (EUA). A
atividade específica do Kit foi de 185 Kilobecquerels (kBq).
O radioimunoensaio (RIE) é um método competitivo de fase sólida, que se baseia na reação imunológica de ligação antígeno-anticorpo, onde o hormônio não marcado a ser dosado e o padrão compete com o traçador (125I- T4) para um número
limitado de sítios de ligação do anticorpo fixados covalentemente na parede interna de tubos de polipropileno. Na fase final do método, os antígenos livres foram decantados, permanecendo no tubo apenas os ligados aos anticorpos citados. A contagem do número
de pulsos por minuto no tubo de polipropileno, ou seja, a emissão de radiação gama do
125I- T
4, foi realizada em contador de cintilação gama, DPC gambyt CR, do
Departamento de Biofísica da UFPE.
Nesta reação de competição, quanto maior a concentração de hormônio livre da amostra, menor a ligação do 125I- T4 ao anticorpo específico com conseqüente redução
na formação do complexo radioativo. Com base nesta proporção inversa, foi calculado o
125I- T
4-anticorpo e assim, dosado o hormônio não marcado através da construção de
uma curva-padrão, empregando-se quantidades crescentes do hormônio padrão de cortisol.
2.3.4.2. Procedimento metodológico
Todas as dosagens foram feitas em duplicatas. Primeiramente, foram colocados com pipeta automática, 25µl das soluções padrão e 25µl de soro a ser dosado, nos tubos previamente identificados. Após esta etapa, foi colocado 1ml do 125I- T4 em cada tubo
os quais foram agitados por aproximadamente 5 segundos. Em seguida os soros foram colocados em banho-maria a 37ºC por 60 minutos. Após o tempo determinado, o líquido dos tubos foi desprezado e a contagem foi feita.
2.3.5. Análise Quantitativa da Glicose Sérica
A glicose foi dosada através da utilização do Kit Glicose PAP - LABTEST DIAGNÓSTICA - BRASIL. O Kit tem como princípio à oxidação da glicose pela glicose oxidase (GOD), segundo a reação abaixo:
GOD
Glicose + O2 + H2O Ácido Glucômico + H2O2
O peróxido de hidrogênio formado reage com 4-Aminoantipirina e fenol sob ação catalisadora da peroxidase (POD), através de uma reação oxidativa de acoplamento que forma uma antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na amostra.
POD
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + fenol antipirilquinonimina + 4 H2O
2.3.5.2. Procedimento metodológico
Primeiramente foram preparados dois tubos, o branco e o padrão. No tubo branco foi colocado apenas 1,0 ml do reagente e no padrão foram colocados 10µl da substância padrão e 1,0 ml do reagente. Depois desta etapa foram preparados os tubos para dosar o nível de glicose dos soros dos ratos, onde foram colocados 10µl de soro e 1,0 ml do reagente, após esta etapa foi misturada vigorosamente a solução e colocada em banho-maria a 37º C, por 15 minutos, depois foi efetuada a leitura das amostras no Espectrofotômetro, Varian, UV-VIS, 634-S usando o comprimento de onda de 520nm.