Structure

La résolution d’une structure d’une PMb est toujours un défi, Encadré. 8. Au début de ma thèse, aucune structure atomique à haute résolution de la TSPO n’existait, bien qu’une grande variété de techniques avaient été utilisées pour acquérir des données structurales à partir de la protéine recombinante.

La TSPO est composée de 169a.a, ce qui représente environ 18 kDa, dont environ 7.7% d’a.a aromatiques, en particulier elle possède 12 tryptophanes (Trp). C’est pourquoi son homologue bactérien fut nommé "Tryptophane rich Sensory PrOtein".

La structure primaire de cette protéine est fortement conservée chez les mammifères, il y a ∼80% d’identité entre les séquences humaine, bovine, murine et de rat [Culty et al.,1999]. L’ana-lyse des différentes séquences en acides aminés suggérait la présence de 5 domaines hydrophobes [Fan et al.,2012].

Les 1erstravaux de topologie par marquage des épitopes ont caractérisé la nature transmem-branaire de ces fragments avec la partie N-terminale dirigée vers l’espace intermemtransmem-branaire et

Alors que lesPMbsont la cible de plus de 50% des médicaments et qu’elles représentent 20 à 40% des protéines codées par les génomes, leur étude accuse un large retard par rapport à celle des protéines solubles (moins de 7% des structures déposés à la PDB (Protein Data Bank) sont des structures dePMb. Cette différence provient d’une part des difficultés à produire des PMb pures et stables en quantités nécessaires à la détermination des structures 3D et d’autre part des difficultés à les cristalliser. Même s’il est possible de surexprimer chez la bactérie une PM, leur extraction et leur isolement nécessitent l’utilisation de détergentsa, afin d’une part de respecter leur nature mixte hydrophile/hydrophobe et d’autre part de conserver leur état natif. Le grand dilemme est que la présence de détergent nécessaire à la solubilisation des PMb, rend ces dernières le plus souvent instables conformationnellement, partiellement ou totalement dépliées ou encore plus ou moins rapidement inactivées. D’où la nécessité de reproduire un environnement mimétique proche de leur environnement natif membranaire pour que la protéine adopte un repliement tertiaire stable permettant l’acquisition de données de bonne qualité. Le choix de l’environnement mimétique membranaire est donc une étape cruciale et, étant donné qu’il n’existe pas de guide universel, une étude au cas par cas est nécessaire. Il existe différents environnements tels que : les micelles de détergent ou les bicelles lipides/détergent ; les amphipols qui permettent de substituer le détergent par un polymère ; les nanodisques dans lesquels une protéine appelée MSP (Membrane Scaffold Protein) s’enroule autour du noyau hydrophobe de lipides contenant la PM ; les lipodisques formées par des phospholipides et le polymère SMA (anhydride maléique stérique) ; et les liposomes, vésicules sphériques de phospholipides avec un c ?ur aqueux. Une fois la PMb stabilisée dans un environnement, elle peut être étudiée par différentes approches expérimentales.

a. Molécules amphiphiles qui se substituent aux lipides et s’adsorbent sur la surface transmembranaire (très fortement hydrophobe) des PMb

Encadré 8 (Biologie structurale des protéines membranaires).

la partie C-terminale cytoplasmique [Joseph-Liauzun et al.,1998].

L’analyse de la structure secondaire de la TSPO entière, en solution, par dichroïsme circulaire (DC) montra un repliement majoritaire en H_α [Jamin and Lacapère,2008,Murail et al.,2008]. Des travaux RMN sur 5 peptides synthétiques correspondants aux 5 domaines hydrophobes ont

confirmé qu’ils adoptaient une structure en hélice α (H_α) [Murail et al.,2008].

On peut noter que cette structuration dépend de la présence du ligand . En effet, Les spectres RMN 2DHSQC²⁷montrent que la structure tertiaire de la TSPO est flexible mais l’introduction du ligand PK11195 entraîne une stabilisation d’une structure tertiaire (ou conformation) [Murail et al.,2008].

En 2010, des cristaux bidimensionnels d’un homologue bactérien de la TSPO (Rhodobacter

sphaeroides) ont été observés par cryomicroscopie électronique et ont permis d’obtenir un modèle

3D à faible résolution (10Å) [Korkhov et al.,2010]. Dans ce modèle, la TSPO s’associe en dimère et on peut observer dans chacun des monomères un faisceau de 5 H_α.

En mars 2014, la stabilisation structurale par le (R)-PK11195 (§1.2.4.1) en RMN du liquide, a permis la résolution de la 1restructure atomique de la TSPO (de souris ; mTSPO) en micelles de détergentDPC [Jaremko et al.,2014].

Cette structure 3D de la mTSPO en complexe avec le PK11195 confirme que la TSPO est composée de 5 H_α transmembranaires (TM1 à TM5), qui lorsque l’on regarde depuis le cytosol dans le sens des aiguilles d’une montre, forment un faisceau compact selon l’ordre : TM1-TM2-TM5-TM4-TM3, Fig.1.15a. La mTSPO contient un grand nombre de résidus prolines. La TM1 est perturbée par la Pro¹⁵, alors que les TM2 et TM3 sont perturbées par un couple de prolines : Pro⁴⁴-Pro⁴⁵ et Pro⁹⁶-Pro⁹⁷ respectivement. La TM5 possède une Pro¹³⁹ qui la coude vers l’espace intermembranaire. Or, les prolines sont des a.a qui, de part leur géométrie particulière, tendent à interrompre les structures secondaires des protéines telles que les H_α et les feuillets β. Les boucles reliant les hélices transmembranaires sont courtes, à l’exception de celle reliant la TM1 et TM2 (résidus Gly²⁸ à Pro⁴⁵) . Les 7 résidus de Glu²⁹à Ala³⁵ se replient en une petite hélice α (H_α0) qui est inclinée le long de l’axe de la TM1 et qui positionne la boucle TM1-TM2 proche de la TM5, Fig1.15a. La TSPO contient également un grand nombre de résidus Trp (12 au total) parmi eux, 4 sont très conservés : le Trp³³localisé dans l’H_α0 dans la boucle TM1-TM2, le Trp⁵³ dans la TM2, le Trp¹²⁶ localisé à la fin de la TM4 et le Trp¹⁴³ dans la TM5. Les Trp⁵³ et Trp¹⁴³ sont proches et contribuent à l’interface TM2/TM5. Ces mêmes Trp pointent vers l’intérieur de la protéine et créent plusieurs contacts avec des résidus voisins ce qui pourrait expliquer que les TM2, TM4 et TM5 soient les plus stables et les plus conservées à travers l’évolution.

Le C-terminal est hautement chargé positivement et dynamique tout comme l’est le N-terminal. Ils n’ont pas de structure stable.

Liaison du PK11195 En accord avec la prédiction de stoechiométrie de 1 :1 pour la liaison

des ligands [Lacapere et al.,2001], un seul PK11195 est observé sur la protéine. Le ligand vient se lier dans une poche formée par les 5 hélices transmembranaires dans la partie supérieure cytosolique du faisceau hélical. Cette cavité hydrophobe est recouverte par la longue boucle qui

27. En RMN du liquide, le spectre HSQC constitue une empreinte de la protéine d’étude et de son état de repliement. L’observation d’un nombre de tâche au moins égale au nombre d’a.ade la protéine, est un signe que la protéine adopte une conformation unique stable

Figure 1.15:Structure RMN haute résolution de la TSPO de souris en complexe avec le PK 11195.a)Représentation en cartoon de la mTSPO avec ses 5 TM (TM1 à TM5) dans la MME, la petite

hélice α (H_α0; formée par les résidus Glu29à Ala35) est également représentée.b)Le ligand PK11195 est

représenté (en rose) au milieu de la cavité formé par les 5 Hα. Les résidus constituant le motif de Schellman

(résidus 103 à 108), dans la boucle reliant les TM3 et TM4 (Loop 3) sont représentés en jaune. Les chaines latérales des résidus Tyr152, Tyr153 et Arg156 essentielles pour la liaison du cholestérol et appartenant au motif CRAC (Cholesterol Recognition Amino acid Consensus ; résidu 149-157) sont représentés en

rouge.c)Vues supérieure cytosolique et inférieure depuis l’espace intermembranaire mitochondrial (IMS

- InterMembrane Space) du PK11195 dans sa cavité. Les boucles reliant chaque TM sont indiquées. Figures réalisées avec le logiciel Pymol en utilisant la structure PDB 2MGY.

relie la TM1 et la TM2 5, Fig.1.15b et c. Le PK11195 est en contact avec plusieurs résidus conservés dans la poche de liaison : Ala²³, Val²⁶, Leu⁴⁹, Ala⁵⁰, Ile⁵², Trp¹⁰⁷, Ala¹¹⁰, Leu¹¹⁴, Ala¹⁴⁷, et Leu¹⁵⁰, Fig.1.16.

Des mutations ont montré l’importance des TM1 et TM2 dans la liaison du PK11195 [Li and Papadopoulos, 1998, Farges et al., 1994]. La cavité de liaison identifiée dans ce complexe mTSPO/PK11195 doit être importante pour les interactions avec d’autres ligands compétiteurs du PK11195. Il a d’ailleurs été proposé que le PK11195 et la PPIX partagent le même site de liaison. D’autres études par mutagénèse ont suggéré que les sites de liaison du Ro5-4864 et

Figure 1.16: Le site de liaison du PK11195. Vue sélective de la poche de liaison du PK11195 à

partir de la stucture de la mTSPO en complexe avec ce ligand. Les résidus directement en contact avec le (R)-Pk11195 sont indiqués. Les résidus montrés importants dans la liaison du Ro5-4864, par mutagénèses

et analyses bioinformatiques, sont encadrés en violet [Farges et al.,1994,Li et al.,2013]. Figure adaptée

deJaremko et al.[2015b].

du PK11195 se chevauchent[Farges et al., 1994]. Ces mêmes études ont montré que les résidus Arg24, Glu29, Leu31, Arg32, Leu37, Lys39, Pro40, Ser41, Trp42, Trp107, Val154 et Trp161 sont importants dans la liaison du RO5-4864. Comme attendu, les résidus impliqués dans la liaison du PK11195 n’interfèrent pas avec le site de liaison supposé du cholestérol (CRAC). Il y a donc bien 2 sites de liaisons distincts pour le PK11195 et le cholestérol.

Figure 1.17: Représentation du passage du cholestérol dans le canal formé par les 5 Hα

de la TSPO. En blanc : les hélices α ; en jaune : le cholestérol. La vue de côté montre la liaison du

Figure 1.18: Vue inférieure depuis l’espace intermembranaire mitochondrial (IMS) de le structure RMN de la mTSPO avec les résidus constituant le motif CRAC (Cholesterol Recognition Amino acid Consensus [L/V-x₁₋₅-Y-x₁₋₅-R/K] ; résidus 149-157). Ces résidus sont représentés en orange et rouge. Les chaines latérales des résidus Tyr152, Tyr153 et Arg156 essentielles pour la liaison du cholestérol sont représentées en rouge. Le PK 11195 est représenté en magenta au centre de la cavité.

Liaison du Cholestérol Dans le modèle cristallographique bactérien proposé par Korkhov

et al. [2010], il est proposé que la TSPO sous forme monomérique pourrait former un tunnel intérieur hydrophobe bordé par le motif CRAC [L/V-x₁₋₅-Y-x₁₋₅-R/K] pour la liaison et la translocation du cholestérol [Rupprecht et al., 2010], Fig.1.17. Il a alors été proposé que le domaine CRAC, situé dans le domaine C-terminal, était localisé le long de TM5 (résidu 149 à 157 - VLNYYVWRD ; [Li and Papadopoulos,1998]). Ce domaine serait au sein d’une crevasse formée par des résidus aromatiques qui enserrent le noyau stérol alors que le groupe hydroxyl serait chapeauté par une arginine, et que la chaine alkyle ferait face à des résidus hydrophobes comme la valine [Jamin et al.,2005]. Cependant, dans la structure RMN, on ne voit pas un tel tunnel hydrophobe qui pourrait permettre la translocation du cholestérol du côté cytosolique vers le la matrice mitochondriale. De plus, les chaines latérales des résidus Tyr¹⁵², Tyr¹⁵³, et Arg¹⁵⁶ essentielles pour la liaison du cholestérol [Li and Papadopoulos, 1998, Jamin et al., 2005] sont localisées à l’extérieur de la structure et pointent vers l’environnement membranaire, Fig 1.18. La grande question est alors comment pourrait se faire le transport du cholestérol si telle est une fonction de la protéine ? Plusieurs auteurs ont suggéré qu’étant donné la capacité connue du cholestérol à se dimériser, celle-ci pourrait mener à l’oligomérisation de la TSPO ce qui permettrait d’assurer la translocation du cholestérol à travers la membrane mitochondriale entre 2 monomères (certains transporteurs ayant été montrés ne pouvant fonctionner qu’à l’état dimérique) [Jaremko et al., 2014, Li et al., 2013]. Cependant, la TSPO de mammifère n’a été montrée former des dimères que sous certaines conditions qui ne sont pas liées à la dimérisation

du cholestérol [Delavoie et al., 2003]. Cette structure n’a donc pas permis de lever le mystère du transport ou non du cholestérol par la TSPO.

Les sites de liaisons confrontés au modèle structural RMN du polymorphisme

hu-main A147T Chez l’Homme, il existe un polymorphisme d’un seul nucléotide²⁸qui conduit à

la substitution de l’Alanine 147 en Threonine (A147T). Cette substitution a lieu dans dans une région très conservée entre les espèces, dans un tour d’hélice précédent le domaine CRAC. 30% de la population caucasienne aurait une T147 [Ramensky, 2002]. Cette mutation est associée à :

• une diminution de la production de pregnénolone [Costa et al.,2009a] ;

• une augmentation de l’incidence des troubles de l’anxiété [Colasanti et al., 2013, Costa et al.,2009b] ;

• une diminution de la liaison à la TSPO de certains ligands pharmacologiques radiomarqués dit de seconde génération [Owen et al., 2014] tels que le XBD173, PBR28 mais aussi du PK11195 mais seulement dans certain cas [Owen et al., 2014]. Ce changement d’affinité des ligands de TSPO pose des problèmes pour les applications médicales puisqu’ils sont utilisés, en imagerie PET, comme biomarqueurs dans certaines pathologies.

Cette diminution de la pregnénolone a été associée à une possible diminution du transport du cholestérol par la TSPO.

Figure 1.19:Superposition de la structure RMN de la mTSPO de souris en complexe avec le PK 11195 sans et avec le polymorphisme A147T (en gris ; code PDB 2N02). Pour chacune des structures, les résidus impliqués dans le domaine CRAC sont représentés . Le PK11195 est représenté en magenta. Le résidu en position 147 est représenté en vert.

28. En génétique, le polymorsphisme à un seul nucléotide correspond à une variation d’une seule paire de bases du génome, entre individus d’une même espèce.

La question se pose alors : comment une mutation qui est loin du domaine de liaison du PK11195, peut-elle modifier la liaison/le transport du cholestérol ? Dans le but de répondre à cette question, un an après la résolution du complexe mTSPO/PK11195 en DPC, la même équipe a déterminé la structure d’un mutant mTSPO présentant ce polymorphosmime A147T [Jaremko et al.,2015b]. Encore une fois cette structure a été résolue en DPC et en présence du ligand (R)-PK11195. En effet, leur mutant A147T lie le (R)-PK11195 avec une affinité similaire à la protéine sauvage. Leur structure montre que la substitution A147T résulte seulement en un changement conformationnelle local autour du site de mutation. Mais la mutation n’influence pas l’intégrité du domaine CRAC. Cette structure n’a donc pas permis de savoir pourquoi ce polymorphisme diminue l’affinité de certains ligands, mais pas du (R)-PK11195. Elle n’a pas non plus permis de déterminer quel est son lien avec la diminution de la production de pregnénolone probablement due à une diminution du transport du cholestérol.

À ce jour, il n’y pas de structure de la TSPO avec et sans cholestérol et c’est probablement ce qui manque pour pouvoir lever le voile sur la fonction qui lie la TSPO au cholestérol. Cela ne pourra se faire en détergent puisque la protéine ne lie pas le cholestérol dans ces conditions. L’étude de la TSPO2, une isoforme de la TSPO découverte chez les mammifères et les oiseaux, pourrait contribuer à mieux comprendre la protéine. En effet, cette protéine possède la capacité de liaison du cholestérol mais présente une très faible affinité pour le PK11195 pourtant le ligand le plus affin de la TSPO mitochondriale.