III.1 Analyse de l’homogénéité de la protéine
Afin de cristalliser une protéine, il a été essentiel de travailler avec une protéine
pure mais aussi homogène en solution, c’est-à-dire sans agrégation. La pureté a été
estimée par l’analyse sur gel et l’homogénéité de la solution par diffusion dynamique
de la lumière (DLS pour Dynamic Light Scattering) qui ont permis d’analyser l’état du
soluté en solution. En effet, il est primordial d’avoir une solution de protéine
monodisperse pour pouvoir aborder une étude structurale. La diffusion dynamique de
la lumière permet non seulement de déterminer la composition d’un tampon dans
lequel la protéine sera stable et non agrégée, mais aussi de mesurer le rayon
hydrodynamique des solutés.
La protéine a été centrifugée pendant 1 h à 13000g à 4 °C afin d’éliminer les
agrégats et les poussières. La cuve de l’appareil Zetasizer NanoS (Malverne) a été
remplie avec 17 L de protéine et le résultat découle d’une dizaine d’acquisition à 25 °C.
L’indice de polydispersité mesuré a permis d’évaluer l’homogénéité de la protéine
récemment purifiée ou décongelée.
III.2 Cristallisation
Des essais de cristallisation ont été réalisés sur la KR1 de la PKS pikromycine, la
KR1 de la PKS lankamycine, la KR6 de la PKS virginiamycine ainsi que la KRA de la PKS
mycolactone afin d’obtenir leur structure. Au laboratoire, nous utilisons la méthode de
diffusion en phase vapeur et la technique de la goutte assise qui a permis l’utilisation
de robots de cristallisation, ainsi que la technique de la goutte suspendue.
Les premiers essais de cristallisation ont été réalisés avec des kits commerciaux
afin d’obtenir les premiers cristaux mais aussi de connaître le comportement de la
protéine dans différentes conditions de pH et de force ionique, par exemple. Les kits
commerciaux utilisés ont été PACT premier (Molecular Dimensions), JCSG-plus
(Molecular Dimensions), Morpheus (Molecular Dimensions), Wizard (Emerald
BioSystems), SaltRX (Hampton research), PGA Screen (Molecular Dimensions),
PEG/Ion Screen (Hampton research), JBS Screen, HR (Hampton research), Index
(Hampton research) et Crystal Screen (Hampton research). Chaque kit est constitué de
96 conditions de cristallisation. Les tests ont été réalisés dans des boîtes de 96 puits de
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type Greiner dans lesquelles chacun des puits est associé à trois cupules (Figure 51).
Les puits ont été remplis des conditions de cristallisation à l’aide du robot Evo 150
(Tecan). Le robot Mosquito (TTP Labtech) a été utilisé pour déposer les gouttes de
cristallisation dans chacune des trois cupules en mélangeant la solution de protéine à
la solution de cristallisation du puits. Trois ratios différents ont été utilisés : une goutte
avec un mélange de 200 nL de solution de cristallisation et 100 nL de protéine, une
goutte avec 100 nL de solution de cristallisation et 200 nL de protéine et une goutte
avec 100 nL de chaque. Une fois les boîtes réalisées, elles ont été placées à 20 °C puis
observées tous les jours à la lampe binoculaire pour suivre l’apparition de cristaux.
Figure 51 : Boîte utilisée lors des essais de cristallisation. Les 96 puits sont remplis avec les différentes conditions de
cristallisation. Au-dessus de chaque puits, les 3 emplacements reçoivent les 3 gouttes de cristallisation avec des ratios différents
(Hampton research).
Lorsqu’une protéine cristallise dans une des conditions d’un kit de
cristallisation, les gouttes sont reproduites manuellement dans des boîtes Linbro de 24
puits, permettant d’augmenter leur volume de l’ordre du L (Figure 52). Elles
permettent d’affiner les cristaux obtenus en faisant varier les différents paramètres
influant la cristallisation que ce soit la concentration en protéine, le pH, la
concentration et nature de l’agent précipitant, la concentration et nature des sels, les
additifs, ou le ratio solution de cristallisation/protéine. Les puits sont remplis de la
solution de cristallisation et les gouttes sont déposées sur des lamelles en verre. Les
lamelles sont ensuite déposées sur le puits et le tout est fermé hermétiquement par un
joint en silicone. Les gouttes se retrouvent suspendues vers le puits dans un système
clos qui induit des échanges entre la goutte et le puits.
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Figure 52 : Représentation d’une boîte Linbro permettant l’affinement des cristaux obtenus avec les kits de cristallisation
(Hampton research).
III.3 Congélation des cristaux obtenus
Pour enregistrer des données de diffraction, il est indispensable de congeler les
cristaux afin de les protéger de la détérioration due aux radicaux engendrés par la
photolyse de l’eau sous le faisceau de rayon X. La congélation limite ainsi la diffusion
des radicaux à l’intérieur du cristal et de ce fait limite sa dégradation. Les cristaux de
macromolécules biologiques contiennent entre 30 et 70% d’eau. Il est donc
indispensable de protéger les cristaux contre la formation de glace lors de la
congélation, sous peine de détériorer le cristal et ainsi perdre le pouvoir de diffraction.
Les cristaux obtenus ont été trempés dans la solution de cristallisation contenant 30 %
de glycérol, qui joue le rôle de cryoprotectant. Ils ont été ensuite congelés dans un flux
d’azote et conservés dans de l’azote liquide.
III.4 Enregistrement et traitement des données
Les données de diffraction ont été enregistrées au synchrotron SOLEIL
(Gif-sur-Yvette) sur les lignes Proxima 1 et Proxima 2. Les clichés de diffraction ont été indexés
et intégrés avec le programme XDS92, puis les données mises à l’échelle par le logiciel
XSCALE92. Pour l’étape de phasage par remplacement moléculaire, plusieurs
programmes ont été utilisés : Phaser93, MolRep94 ou encore Balbes95 en utilisant
comme modèles les structures les plus proches à savoir : la KR1 de DEBS (fichier PDB :
2FR0), la KR1 de la PKS tylosine (2Z5L), la KR2 de la PKS amphotéricine (3MJE) et la
KR3 de la PKS pikromycine (3QP9). Cette méthode consiste à positionner la protéine
dans le cristal étudié en déterminant la matrice de rotation et le vecteur de translation,
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et permet de résoudre le problème de la phase en utilisant la structure d’une protéine
homologue.
III.5 Obtention de dérivés d’atomes lourds de cristaux de
protéine
Des cristaux ont été produits en boîte Linbro en présence de lanthanides pour
résoudre le problème de la phase, étant donné que la KR1 de la PKS lankamycine ne
contient que deux méthionines. Il est donc impossible d’utiliser le signal anomal du
sélénium apporté par les sélénométhionines qui remplacent les méthionines de la
protéine. Les lanthanides, qui regroupent les éléments avec un nombre atomique de 57
à 61, ont alors été utilisés dans les conditions de cristallisation à des concentrations
allant de 10 à 100mM. Dans ce cadre, nous avons utilisé différents lanthanides comme
l’europium, l’ytterbium et le gadolinium (Eu, Yb, Gd) chélatés avec plusieurs
composés : DOTA (acide 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetra-acetique),
DO3A (acide 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetique), (DPA)3
(tris(dipicolinate) et HPDO3A (acide
10-(2-hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetique)96,97 (NatXRay) (Figure 53). Les lanthanides
sont des diffuseurs anomaux et permettent de résoudre le problème de la phase par
SAD (Dispersion Anomale à une Seule longueur d’onde) ou MAD (Dispersion Anomale
à Multiple longueur d’onde).
Figure 53 : Les lanthanides sont en vert et chélatés par quatre molécules différentes.
Afin d’obtenir des dérivés d’atomes lourds, deux méthodes principales existent ;
le trempage et la co-cristallisation. Le trempage consiste à faire tremper les cristaux
dans un mélange contenant la solution de cristallisation et des lanthanides. Les
lanthanides diffusent alors à l’intérieur du cristal. La co-cristallisation consiste à faire
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méthode est plutôt utilisée lorsque le trempage ne permet pas d’obtenir des dérivés
d’atomes lourds car la co-cristallisation présente des défauts, notamment d’inhiber la
cristallisation.
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Étude multidisciplinaire des aspects clés de la biosynthèse des polykétides par des polykétide synthases modulaires
(Page 89-93)