Structure du complexe synaptique de la résolvase de 

Comme nous l’avons vu, la recombinaison spécifique de site catalysée par les recombinases à sérine les mieux caractérisées in vitro requiert la formation de multimères de recombinases, de grandes molécules d’ADN superenroulées portant les sites de recombinaison et plusieurs sites de fixation, et parfois des facteurs protéiques supplémentaires. L’obtention de mutants capables de catalyser la réaction de recombinaison sur des petits substrats linéaires, et sans facteurs additionnels, a permis de faciliter énormément les études biochimiques et structurales (Arnold et al., 1999; Burke et al., 2004; Sarkis et al., 2001). Plusieurs structures pour la résolvase de  ont été déterminées : la structure du domaine catalytique (Rice and Steitz, 1994b; Sanderson et al., 1990) ; la structure de la protéine pleine taille (Rice and Steitz, 1994a) ; et la

(A)

Figure 31: Structure tridimensionnelle de la résolvase du transposon GD synaptique.

(A) Séquence du substrat ADN de 34 pb, analogue du sous-site I du site res, utilisé pour la déter- mination de la structure du complexe pré-synaptique. La séquence originale est indiquée par les lettres en italique.

(B) Structure du complexe pré-synaptique, impliquant un dimère de résolvase (vert et jaune) et deux substrats ADN (bleu).

(C) Modèle de formation du synaptosome. Les deux substrats ADN peuvent être assemblés de deux façons: soit l'ADN se trouve à l'intérieur du dimère (gauche), soit il se trouve à l'extérieur (droite).

(D'après Yang and Steitz, 1995)

Domaine de fixation à l'ADN Domaine catalytique

(B)

(C)

structure d’un dimère de résolvase en complexe avec un dérivé du site I (complexe pré- synaptique (figure 31) (Yang and Steitz, 1995a).

Chaque monomère de la résolvase est constitué de trois domaines : un domaine catalytique N-terminal (1-100, section 2.1), un domaine de fixation à l’ADN C-terminal (148-183), et une région formant un long "bras" (101-147) (figure 31). Cette dernière région relie le domaine catalytique au domaine de fixation à l’ADN par une longue structure en hélice (hélice E, 101-136) et une région non structurée (137-147). L’interface de dimérisation de la protéine se forme principalement par des contacts entre des résidus conservés des régions N-terminales des deux "bras", via des interactions hydrophobes et un pont hydrogène entre les résidus G118. Le domaine de fixation à l’ADN est apparenté à celui observé dans l’invertase Hin (Feng et al., 1994). Il s’agit d’un domaine à trois hélices , la première hélice étant quasiment antiparallèle par rapport au deux autres, qui forment un motif HTH. Dans le dimère complexé à un substrat de 34 pb contenant le site de coupure en son milieu, l’ADN est complètement entouré par le dimère. Dans le dimère, les motifs HTH se fixent sur l’ADN de manière symétrique. Des interactions ADN-protéine sont établies via le domaine de liaison à l’ADN HTH, qui forme des ponts hydrogène et salins avec le sillon majeur de l’ADN dans la partie externe du demi-site (14-9), et la région C-terminale de l’hélice qui interagit avec le sillon mineur de l’ADN dans la partie interne du demi-site (8-1) (figure 31A) (Yang and Steitz, 1995b). Les résidus de l’hélice E (en particulier le résidu conservé R125) maintiennent l’ADN près du site actif, et son extrémité 3’ après le clivage. Deux modèles de formation de la synapse, selon la façon dont les deux sites de recombinaison sont assemblés par les deux dimères de résolvase, ont été proposés à partir de ces structures : soit l’ADN se trouve à l’intérieur, entre les deux dimères, soit il se trouve à l’extérieur (figure 31C).

Plusieurs études complémentaires ont permis de trancher en faveur du second modèle (Li et al., 2005; Nollmann et al., 2004). La structure d’un complexe post-synaptique formé par un tétramère de résolvase lié covalemment à deux substrats ADN dérivés du site I clivés a notamment été obtenue (Li et al., 2005). Cette structure montre un complexe dans une situation intermédiaire, avant le processus d’échange de brin. Elle comprend un dimère de résolvase dont chaque sous-unité est fixée et liée covalemment à un demi-site (L ou R, ou dimère parental), associé à un autre dimère dont les sous- unités sont fixées et liées covalemment à un autre demi-site (L’ ou R’, ou second dimère parental, figure 32A). Au coeur de ce complexe tétramérique, se trouvent deux paires

(A)

Figure 32: Structure tridimensionnelle de la résolvase du transposon GD synaptique.

(A) Modèle de formation de la synapse et de la réaction de recombinaison. Les sous-sites I du site res sont représentés par des flèches (site I, vert et site II, rouge). Chaque sous-site est formé de deux demi-sites (L et R ou L' et R').

(B) Structure du complexe post-synaptique, impliquant deux dimères de résolvase (vert, bleu, rose et rouge) et deux substrats ADN.

(C) Vue du complexe post-synaptique montrant l'alignement anti-parallèle des deux paires d'hélices E.

(D) Les deux modèles expliquant le positionnement des sites en configuration de recombinai- son: le glissement des domaines catalytiques "Domain Swap" ou la rotation des sous-unités.

(D'après Li et al., 2005)

(B)

(C)

(D)

Domaine catalytique

d’hélices E dans une orientation antiparallèle et formant un X (figure 32C). Dans cette configuration, chaque monomère de résolvase interagit avec les trois autres dans le tétramère par la partie N-terminale de son hélice E. La comparaison entre la structure du complexe pré-synaptique et celle du complexe post-synaptique montre de larges changements conformationnels (Li et al., 2005). Les principaux changements observés dans le tétramère sont : (i) le résidu sérine catalytique s’est déplacé de 11Å vers le site de clivage, (ii) une courbure est apparue dans l’hélice E, (iii) les hélices E d’un dimère parental forment un angle de 100°, alors qu’il était de 45°.

Les analyses topologiques ont montré que le processus d’échange de brin implique une rotation de 180° d’un demi complexe par rapport à l’autre, pour positionner les brins en configuration de recombinaison (en général dans le sens des aiguilles d’une montre pour relâcher la super-hélicité négative des substrats, ou dans les deux sens pour des substrats linéaires). Deux possibilités ont été envisagées pour expliquer ce phénomène : le glissement du domaine catalytique (Burke et al., 2004; Grindley, 2002), ou la rotation des sous-unités (Li et al., 2005)(figure 32D). Dans le premier modèle, les hélices E restent en place, et c’est une paire de sites catalytiques (par exemple ceux qui sont fixés aux demi-sites L et L’) qui glissent et échangent leur place. Ce modèle est difficilement conciliable avec la capacité de la recombinase à effectuer un second cycle d’échange de brin (rotation de 360°) dans le cas où les dinucléotides centraux des sites de recombinaison ne s’apparient pas (section 2.2). Le second modèle repose sur les propriétés de l’interface qui sépare les deux demi-sites gauche et droite (figure 32B). Cette interface est très lisse et présente très peu d’interactions spécifiques, ce qui permettrait la rotation des deux demi-sites l’un par rapport à l’autre. Ce modèle a été confirmé pour l’invertase Hin, par des expériences de "crosslink" (Dhar et al., 2004).

6.2. Les transposases à sérine

Les transposases à sérine décrites dans ce chapitre font partie de la famille des recombinases à sérine de grande taille. Leur domaine catalytique est le seul domaine conservé commun aux recombinases à sérine classiques. Aucune structure n’est disponible pour ce type de recombinase, mais différents domaines ont été définis (figure 33).

Le domaine de fixation à l’ADN retrouvé généralement dans les recombinases à sérine est un motif HTH, mais cette caractéristique ne semble être observée pour aucune des

Domaine catalytique

Dimérisation

Fixation à l'ADN

Région chargée Motif CCCC Région riche en résidus leucine Région chargée Région riche en résidus cystéine

Catalyse

Figure 33: Organisation schématique de la transposase TnpX du transposon Tn4451. Les différents motifs sont définis par des rectangles gris. L'axe est gradué en paires de bases. Les différentes régions sont définies selon leurs fonctions putatives: catalytique, dimérisation, fixation à l'ADN. Les domaines I, II, et III ont été définis par des expériences de protéolyse limitée.

D'après Adams et al., 2004

enzymes de la famille des recombinases de grande taille. Plusieurs domaines de liaison à l’ADN putatifs ont été proposés pour la transposase TnpX (figure 33) (Adams et al., 2004; Adams et al., 2006). Deux régions portant des résidus polaires ou chargés (533- 597 et 249-310) semblent contenir les sites de fixation à l’ADN. De plus, la transposase possède plusieurs motifs putatifs de fixation au zinc, retrouvés fréquemment dans les facteurs de transcription, dans les régions 324-360, 591-612 et 639-660. Ces deux derniers motifs ne sont par ailleurs pas essentiels pour l’activité de la protéine (excision, intégration, transposition, et dimérisation et fixation de l’ADN in vitro (Adams et al., 2004). TnpX est un dimère en solution. La structure secondaire prédite du domaine 324- 360 correspond à un motif de type doigt de zinc atypique LX5CX2CGX13-27YXCX2- 21C ou CCCC, capable de médier l’homo- ou l’hétérodimérisation (Iyer et al., 2001; Lucet et al., 2005). Une région riche en résidus leucine et valine pourrait également constituer un site de dimérisation et faciliter la fixation à l’ADN.

Des études de la TnpX par protéolyse limitée ont mis en évidence trois domaines (I, II et III, figure 33) (Lucet et al., 2005). Le domaine I correspond à la région 1-170 qui contient le domaine catalytique conservé. Une caractéristique majeure dans la structure du complexe synaptique de la résolvase de  est la présence de la longue hélice E qui relie le site catalytique au site de fixation à l’ADN (région 101-147 de TnpR). TnpX, et les recombinases de grande taille contiennent un domaine putatif analogue situé en C- terminal du domaine catalytique contenant les résidus conservés E118, R119, E124, R125, et G137. Le domaine II (170-266) inclut deux régions conservées parmi les recombinases à sérine de grande taille (Smith and Thorpe, 2002). Ce domaine porte notamment la région conservée 243-261 essentielle pour l’excision et l’intégration de l’élément (Adams et al., 2006). La fonction de cette région semble être médiée par des interactions avec le domaine C-terminal (région 598-707). Le domaine III s’est avéré très résistant aux digestions protéolytiques et contient des domaines putatifs de dimérisation et de fixation à l’ADN décrits ci-dessus. Cette organisation potentielle en trois domaines rappelle celle de la résolvase de . Les recombinases spécifiques de site à sérine possèdent un domaine catalytique commun. Les autres domaines non apparentés de ces protéines semblent avoir co-évolué avec leurs substrats de recombinaison, pour optimiser leur reconnaissance et la régulation du processus de recombinaison. Ceci a conféré à ces diverses enzymes des fonctions très différentes, qui ont été abordées dans ce chapitre. La construction de recombinases chimériques a montré que ce domaine catalytique pouvait fonctionner de manière indépendante des

II . Les transposases à sérine

63 autres domaines, et que le domaine contenant le motif HTH semblait n’avoir qu’un rôle de reconnaissance de l’ADN. Par exemple, une recombinase chimérique, contenant le domaine catalytique de la résolvase de Tn3 fusionné au domaine de reconnaissance de l’ADN du facteur de transcription Zif268, un motif en doigt de zinc, est capable de catalyser la recombinaison spécifiquement au niveau de la cible reconnue par Zif238 (Akopian et al., 2003).

Figure 34: La famille des recombinases spécifiques de site de type tyrosine.

Organisation et fonctions de quelques exemples de recombinases à tyrosine. La figure montre le domaine catalytique (jaune), la position du résidu tyrosine (étoile), le domaine de liaison à l'ADN très variable (tons rosées), et un domaine N-terminal additionnel parfois présent (bleu).

D'après Smith et al., 2002 et Grindley et al., 2006

XerC/D, Cre Exemples Structure Fonction Excision: résolution de dimères Y Inversion Tn916 Transposition Intégration Excision Phages N C N C * * * N C Flp