Le stress oxydatif chez les rats BDL

Le niveau des radicaux libres oxygénés dans le plasma après

un traitement avec de la BUM

Chez les rats BDL, il y a présence d’œdème cérébral, d’hyperammoniémie et de stress oxydatif plasmatique. L’AST-120 atténue l’œdème cérébral et l’hyperammoniémie (Bosoi, 2011a) et a pu atténuer la surexpression génique du NKCC1 dans cette présente étude (Figure 31). Le traitement avec la BUM chez les rats BDL a dénoté les mêmes effets sur l’œdème (Figure 27), l’expression génique du NKCC1 (Figure 32) et l’hyperammoniémie (Figure 35). L’étude a alors été dirigée vers la présence de stress oxydatif systémique chez les rats BDL, qu’un traitement avec l’AST-120 ne peut éliminer (Bosoi, 2011a) et qui n’est pas observable chez les rats PCA. Ainsi, pour déterminer si le stress oxydatif joue un rôle dans le développement de l’œdème cérébral chez les rats BDL et si le traitement avec la BUM a le même effet que l’AST-120 sur le stress oxydatif, les niveaux de ROS chez les rats BDL traités avec la BUM ont été évalués.

Il a été trouvé que le niveau de radicaux libres dans le plasma des rats BDL ayant subi le traitement de BUM reste élevé, tout comme chez les rats BDL non-traités comparé aux rats BDL SHAM non traités (Figure 18 C). En effet, la Figure 36 montre un niveau de radicaux libres plus élevé chez les rats BDL + BUM (6.89 UFR ± 1.66) que chez les rats BDL SHAM + BUM (0 UFR).

Alors, la BUM diminue le NH3/NH4+ dans le plasma et l’œdème cérébral mais

ne diminue pas le stress oxydatif présent dans le plasma artériel. Ceci est similaire à l’AST-120 qui n’a pu atténuer le stress oxydatif (Bosoi, 2011a). Donc, le stress oxydatif sans hyperammoniémie n’est pas associé à l’œdème cérébral puisque le haut niveau de ROS reste présent même après la résolution de l’oedème cérébral.

Figure 36. Le niveau des radicaux libres oxygénés dans le plasma artériel chez les rats BDL traités avec la bumetanide

Une augmentation significative de ROS a été trouvée chez les rats BDL (n = 6) comparé aux rats BDL SHAM (n = 6). Ces deux groupes ont été traités avec des injections de BUM. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyennes ± S.E.M.

Carbonylation des protéines

Un marqueur de stress oxydatif a été étudié afin de confirmer que le stress oxydatif n’est pas impliqué dans la pathogenèse de l’œdème cérébral. La carbonylation est une modification oxydative irréversible de protéines qui est induite par les radicaux libres (Suzuki et al., 2010). Une augmentation du niveau de carbonylation des protéines indiquerait un déséquilibre causé par les ROS. Puisque la présence du stress oxydatif n’a pas été constatée dans le LCR et les tissus cérébraux (Bosoi, 2011b), les cellules endothéliales de la BHE forment un mur maintenant les ROS hors du SNC, mais qui est toutefois susceptible d’être abîmé par les ROS. L’ajout d’un groupe carbonyle (C=O) à leurs protéines serait une indication que le stress oxydatif affecte les protéines de la BHE chez les rats BDL et jouerait un rôle dans la pathogenèse de l’EH minimale.

Le niveau de carbonylation des chaînes latérales des protéines dans les CMV des rats BDL a été estimé par immunobuvardage après une dérivation avec du 2,4- dinitrophénylhydrazine (DNPH). À la Figure 37, chez les rats BDL SHAM et les rats BDL, un niveau similaire de groupes carbonyles a été observé. L’expression relative par rapport à la β-actine de la bande de taille d’environ 140 kDa a été de 1.09 ± 0.12 pour les rats BDL SHAM et de 0.95 ± 0.33 pour les rats BDL. Pour la deuxième bande de taille entre 140 kDa et 100 kDa, elle a été de 0.59 ± 0.01 pour les rats BDL SHAM et de 0.50 ± 0.20 pour les rats BDL. Enfin, pour la bande près de 100 kDa, elle a été de 0.67 ± 0.08 pour les rats BDL SHAM et de 0.76 ± 0.21 pour les rats BDL. Pour les trois protéines, aucune de ces variations n’a été significative. Ces bandes ont été celles qui étaient les plus clairement apparentes sur le gel. En résumé, la carbonylation des protéines dans les CMV ne diffère pas chez les rats BDL malgré la présence de ROS dans le plasma. L’absence de carbonylation supporte l’hypothèse que les ROS sanguins n’affectent pas les CMV de la BHE.

Figure 37 La carbonylation de chaînes latérales des protéines des microvaisseaux sanguins cérébraux chez les rats BDL

La détermination du niveau de carbonylation des chaînes latérales des protéines dans les CMV des rats BDL SHAM (n = 4) et BDL (n = 4) a été accomplie par la détection des dérivés de DNP par immunobuvardage. Aucune différence significative n’a été observée dans les groupes carbonyles. Trois bandes ont été quantifiées : la protéine la plus près de 140 kDa, la protéine suivante (entre 140 kDa et 100 kDa) et la protéine la plus près de 100 kDa. Leur expression relative a été calculée en normalisant la densité des bandes des dérivés carbonyles avec celle des bandes de β-actine correspondantes. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyennes ± S.E.M.

Étant donné que l’implication du NKCC1 et de l’hyperammoniémie chronique seule n’a pas pu expliquer l’œdème cérébral, nous avons dû nous tourner vers d’autres mécanismes possibles. Le stress oxydatif a été choisi parce qu’il est élevé dans le plasma des rats BDL (Bosoi, 2011b). Le stress oxydatif systémique est resté présent,

même en absence d’œdème cérébral réduit par une thérapie de BUM (Figure 36) ou d’AST-120 (Bosoi, 2011a). Cela indique que le stress oxydatif sans hyperammoniémie n’est pas un facteur impliqué dans la pathogenèse de l’œdème cérébral. L’absence de carbonylation des protéines des CMV appuie cette conclusion. Cela répond à notre quatrième objectif : l’hyperammoniémie et le stress oxydatif indépendants ne jouent pas un rôle dans la pathogenèse de l’œdème cérébral.

Discussion

La Figure 38 résume les résultats de ce projet. Chez les rats BDL, l’œdème cérébral est associé avec; i) l’absence d’extravasation de macromolécules de différentes tailles dans le cortex; ii) aucun changement dans l’expression des protéines des JS et iii) aucune activation des MMP-2 et -9 dans le cortex préfrontal. Nous pouvons en conclure que l’œdème cérébral chez les BDL n’est pas d’origine vasogénique mais de type cytotoxique. Les mêmes résultats ont aussi été observés chez les rats PCA, qui ne présentent pas d’œdème cérébral. Comme les niveaux d’hyperammoniémie sont similaires chez les rats BDL et les rats PCA, cela suggère qu’une augmentation de l’ammoniaque (150-250 µM) ne cause pas d’insulte à l’intégrité de la BHE et ne cause pas l’œdème cérébral indépendamment.

La traitement avec de la bumetanide (BUM) a produit une multitude d’effets aux rats BDL : i) une diminution de l’œdème cérébral; ii) une atténuation de l’augmentation d’expression génique du co-transporteur Na-K-Cl (NKCC1) dans les microvaisseaux sanguins cérébraux (CMV); iii) une atténuation de l’hyperammoniémie; iv) mais aucun changement du stress oxydatif sanguin. La BUM induit les mêmes effets que l’AST-120 (adsorbant du NH3/NH4+ sur l’œdème, l’hyperammoniémie, le stress oxydatif (Bosoi,

2011a) et l’ARNm codant pour le NKCC1 dans les microvaisseaux sanguins cérébraux (CMV). Il a été conclu que cette augmentation d’ARNm est associée à l’œdème mais n’est pas liée à l’hyperammoniémie chronique seule puisque cela n’a pas été trouvé chez les rats PCA. L’élévation de la transcription génique n’a pas été associable à une augmentation d’expression protéique ou de phosphorylation du NKCC1 dans les CMV en relation avec le développement de l’œdème cytotoxique chez les rats BDL. Néanmoins, la BUM et l’AST-120 diminuent l’hyperammoniémie et l’œdème cérébral. Cela suggère qu’un facteur additionnel au NH3/NH4+ favorise le développement de

l’œdème chez les rats BDL. Les résultats de cette étude suggèrent que le stress oxydatif seul n’induit pas l’oedème car les niveaux de radicaux libres oxygénés (ROS) dans le

sang des BDL ne varient pas lorsque l’œdème cérébral et l’hyperammoniémie sont atténués par la BUM et l’AST-120. L’absence de variation de la carbonylation des protéines des CMV malgré la présence du stress oxydatif dans le plasma appuie cette dernière conclusion. Toutefois, le stress oxydatif est présent avec l’hyperammoniémie dans le développement de l’œdème cérébral. Cela suggère qu’il y a un effet synergique entre le stress oxydatif et l’hyperammoniémie dans la pathogenèse de l’œdème cérébral dans la cirrhose du foie.

Figure 38. Résumé des résultats du projet

L’œdème cérébral chez les rats BDL n’est pas d’origine vasogénique mais plutôt d’origine cytotoxique. Le NKCC1 et le stress oxydatif comme facteur indépendant ne sont pas impliqués dans la pathogenèse de l’œdème cytotoxique chez les rats BDL. Le bleu pâle des cases correspond aux observations obtenues chez les rats BDL. Le bleu foncé représente les rats PCA.

1. Origine de l’œdème cérébral chez