es animaux élevés dans le but d'une production alimentaire (pour leur lait ou leur
viande) peuvent être exposés à divers antibiotiques en cas d’infections ou de
maladies. Par conséquent, un de ses agents thérapeutiques peut être présent dans les aliments produits à partir d'animaux traités et donc devenir dangereux pour la santé des
consommateurs en produisant une résistance à ces antibiotiques69–71. Parmi ces antibiotiques,
la streptomycine (MW : 583.6 g.mol-1) associée à la pénicilline a été couramment utilisée par
les vétérinaires pour traiter les infections chez les bovins comme la mammite, l'inflammation des pies de la vache. Bien que cet antibiotique ne soit pas utilisé pour traiter les humains, il est ainsi possible de retrouver de la streptomycine dans les produits d’origine bovine, ce qui peut avoir de graves conséquences sur la santé humaine (insuffisance rénale, problème d’oreille interne, éruptions cutanées, …). La surveillance et la détection de cet antibiotique dans la chaîne alimentaire sont donc indispensables avant son entrée sur le marché et sa
commercialisation72–74. L’agence européenne pour l'évaluation des médicaments (AmEA) et la
commission de régulation européenne (Règlement n ° 37/2010) ont mis en vigueur une limite
maximale de sécurité pour la streptomycine de 200 μg.kg-1 pour le lait et de 500 μg.kg-1 pour
la viande75,76.
Il existe déjà plusieurs méthodes pour détecter la présence de streptomycine comme par exemple, des méthodes microbiologiques, photométriques ou séparatives comme la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Malheureusement, les méthodes microbiologiques sont lentes (entre plusieurs heures à plusieurs jours). Ce temps d’expérimentation va ralentir la prise en charge du problème et rallonger le traitement associé. De plus, ces techniques ont une reproductibilité, une fiabilité (il peut y avoir des faux positifs) et une sensibilité assez faible et une LOD d’environ une centaine de µM. Les autres techniques de caractérisation comme l’HPLC sont généralement très coûteuses et demandent
un personnel très qualifié69,77,78.
Ainsi, il est important de trouver une méthode simple (pour être accessible), rapide (diminuer le temps avant le traitement et du traitement), sensible, à faible coût et portable (pour pouvoir utiliser le capteur facilement sur site). Les biocapteurs optiques sont alors de
bons candidats (voir chapitre 1 A).
Figure 39 : Représentation de la molécule d'Adénine (A), de Cytosine (C), de Guanine (G) et de Thymine (T)
D
L
Chapitre 3 : Détection bimodale A) La streptomycine et son aptamère
63
Dans le cas de la streptomycine, il est possible d’utiliser un aptamère comme
biorécepteur. Les aptamères sont des oligonucléotides synthétiques le plus souvent d’acides
désoxyribonucléiques (ADN). Les bases utilisées sont l’adénine (A), la cytosine (C), la guanine
(G) et la thymine (T) (Figure 39). Un aptamère est composé d'un simple brin d'ADN ayant une
séquence spécifique. Cette séquence lui confère une conformation présentant une forte affinité avec l'analyte à détecter. Les séquences sont définies à partir de la méthode SELEX. Le
principe est d'isoler et de sélectionner in vitro les oligonucléotides qui se lient avec la plus
haute affinité à une cible donnée. Ceci se fait à partir de banques combinatoires d’un grand
nombre de séquences aléatoires et d'une méthode de sélection itérative appelée évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel. Ensuite, il faut séparer les différentes séquences ayant réagi avec la cible par chromatographie d’affinité en gel natif, par séparation sur membrane ou avec des billes magnétiques. L’étape suivante est de séparer les oligonucléotides de la cible et de les amplifier par clonage ou par réaction en chaîne par
polymérase. Ces étapes sont renouvelées plusieurs fois jusqu’à l'obtention des
oligonucléotides ayant la plus grande affinité pour la cible. Les propriétés particulières et leur capacité de repliement en trois dimensions leur permet d’avoir une sélectivité, une spécificité
et une affinité très élevées71,77,79. En effet, un aptamère a l’avantage de pouvoir être spécifique
d’une molécule particulière (plus de 90 %) et très peu pour des molécules ayant presque les
mêmes caractéristiques chimiques (moins de 5 %). Les aptamères sont plus avantageux par rapport aux anticorps notamment, car ils ont une meilleure stabilité (se détériorent peu avec le temps, et peuvent être conservés plusieurs mois), une plus grande pureté (>85 %), des modifications de chaîne ou de terminaison plus facile, une plus grande facilité de stockage (congélateur sous forme d’aliquots ou sous forme solide), aucune variation d'un lot à l'autre, … Ces avantagesont permis aux aptamères d’être de plus en plus utilisés.
Figure 40 : a) Structure de la streptomycine b) structure de l’aptamère c) visualisation de l’interaction entre l’aptamère et la streptomycine
On peut voir sur la Figure 40 a), que la structure de la streptomycine comporte
plusieurs groupements chimiques, notamment des groupements amine et des cycles aromatiques procurant à la molécule une section efficace importante et pouvant donner un
signal Raman intéressant. Sur la Figure 40 b), on peut également voir la structure de
l’aptamère que j'ai utilisé pour capturer la streptomycine. Sa séquence a été définie à la suite
d'une étude sur trois structures différentes78. Dans cette étude, une constante de dissociation
de 132.3 nM a été calculée pour cet aptamère. Une étude de la spécificité a été réalisée montrant une spécificité de plus de 90 % pour la streptomycine et a une très faible spécificité
Chapitre 3 : Détection bimodale A) La streptomycine et son aptamère
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pour les autres molécules proches (gentamycine 10 %, amikacine 20 %, chlorphéniramine 5
%, clindamycine 5 % et ampiciline 1 %)78. La Figure 40 c) montre une étude théorique de la
conformation de l'aptamère lors de son interaction avec la streptomycine qui se lierait alors à l’aptamère par l'intermédiaire des bases A14, G16, A17, T18 et C19.
Pour concevoir le biocapteur, l’aptamère doit être accroché à la surface d’or. Pour cela,
j'ai choisi de greffer un groupement thiol en position 5’ à l'extrémité de la séquence de l'aptamère. Ce groupement m'a permis d’obtenir une couche d'aptamères à la surface des
nanostructures et de la surface d’or du quartz de QCM.
Pour assurer la reconnaissance entre la streptomycine et l'aptamère, j’ai utilisé un
tampon spécifique composé des éléments suivants : 5 mM de MgCl2 + 0.1 M de NaCl + 20 mM de TrisHCl.
Chapitre 3 : Détection bimodale B) Développement du transducteur bimodal
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