Stratégie de bioconjugaison

Bien que la construction de plusieurs systèmes multivalents ait été rapportée dans la littérature scientifique, l’ingénierie moléculaire de systèmes multivalents reste un challenge considérable qui requiert l’utilisation de méthodes de bioconjugaison basées sur les ligations click. En effet, la construction de clusters multivalents implique de bons rendements et une excellente chimiosélectivité. Ces deux critères sont indispensables pour faciliter l’élimination des réactifs et produits secondaires.

1. Ligations click

Les ligations de types click ont été envisagées dans le but de passer outre les limitations de la synthèse étape par étape. Les réactions appartenant à la chimie click doivent répondre à des critères précis : être modulable, être applicable à un large panel de molécules et ne générer que des produits secondaires facilement éliminables.^[41] La mise en œuvre de ces synthèses doit également répondre à plusieurs critères : être réalisable dans des conditions

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douces et simples, les réactifs doivent être facilement disponibles et le produit doit pouvoir être isolé aisément. La préparation de liaisons carbone-hétéroatomes de manière click englobe les réactions de substitutions nucléophiles, de condensations de carbonyles et de cycloadditions d’espèces insaturées. La chimie click, quand elle est appliquée aux systèmes vivants, nécessite en outre d’être biocompatible et réagir de façon bio-orthogonale.[42]

a. Ligation azoture-alcyne catalysée au cuivre

La réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire entre un groupement acétylène et un azoture permettant la préparation de triazole, a été introduite en 1963.^[43] Cette première synthèse nécessitait un chauffage du milieu réactionnel, pour obtenir le produit désiré avec un rendement acceptable incompatible avec les systèmes biologiques. C’est en 2002 que la catalyse au Cu^I a été réalisée (Figure 6).^[44] Cette accélération de la vitesse de réaction semble être expliquée par la formation d’un métallo-cycle de six membres mettant en jeu du Cu^III.^[45] L’énergie d’activation de formation du triazole est, grâce au cuivre, réduite d’une valeur de 26,0 kcal.mol^-1 à 14,9 kcal.mol^-1. Ainsi cette réaction est devenue très efficace dans l’eau et elle offre de bons résultats en conditions aqueuses. Depuis d’autres propositions ont été faites pour expliquer le mécanisme de catalyse de cuivre, avec par exemple la présence de deux atomes de Cu^I.^[46]

Figure 6. Mécanisme réactionnel de la cycloaddition azoture-alcyne catalysée par le cuivre proposé en 2002^[44a]

Cette ligation click a largement été employée dans la construction d’inhibiteurs enzymatiques. Ainsi, la cycloaddition azoture-alcyne catalysée au cuivre a permis de fonctionnaliser sélectivement les protéines, de modifier les surfaces virales ou encore de fixer des oligonucléotides.^[43b] Malgré ce large engouement, le cuivre reste un métal toxique

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pour les cellules.^[47] D’autres ligations tels que les cyclooctynes ont alors été proposées pour éviter l’emploi du catalyseur. Ces groupements sont en effet plus réactifs et l’utilisation du cuivre n’est pas nécessaire, mais la régiosélectivité de la réaction est alors perdue.

b. Thiol-ène

La ligation thiol-ène est une hydrothiolation d’un alcène terminal, découverte en 1905, et c’est en 1938 que le mécanisme radicalaire a été proposé (Figure 7).[48] Un radical thiyl est généré par l’action de la lumière et/ou en présence d’un initiateur de radicaux. Le radical est ensuite additionné à l’alcène pour induire la formation d’un radical thioalkyl selon un mécanisme anti-Markovnikov. Le thioalkyl désiré est obtenu par la réaction du produit issu de l’addition avec le radical hydrogène généré à partir du thiol. La propagation radicalaire est alors initiée.

Figure 7. Mécanisme radicalaire de la réaction de thiol-ène impliquant un photoinitiateur

Initialement réservée à la préparation de thioesters,^[49] la thiol-ène fait l’objet ces dernières années d’applications destinées à la préparation de matériaux et de polymères.[50] La thiol-ène a également été largement utilisée pour la préparation de systèmes multivalents dendritiques ou encore pour la fonctionnalisation de plate-formes telles que des cages de silice,^[51] des calixarènes^[52] ou encore des cyclodextrines.^[53] L’efficacité notable de la thiol-ène pour la construction de ces clusters permet de la définir comme une ligation click.^[54] Cette ligation n’est pas chimiosélective des groupements protecteurs arylés souvent utilisés dans la chimie des sucres. Des étapes de déprotections/protections sont alors indispensables pour modifier la nature de ces groupements avant d’initier le réaction.

c. Réactions de condensation de carbonyles

Les réactions de condensation de carbonyles reposent sur la libération d’une molécule d’eau (Figure 8).

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Figure 8. Réaction de condensation de carbonyles

Imine. L’imine est une réaction de condensation impliquant une fonction amine et un aldéhyde. Cette liaison présente des limitations pour être considérée comme une ligation de type click. En effet, lorsque la réaction est réalisée en milieu aqueux, la stabilité du système généré est très réduite. Les molécules d’H₂O vont jouer un rôle nucléophile pour dissocier les composés, et tendre à déplacer l’équilibre vers la régénération de l’aldéhyde et de l’amine initiaux. La formation de cette liaison peut malgré tout être favorisée grâce à la présence de liaisons non covalentes annexes pour stabiliser le système.^[55] L’équilibre peut être fixé en réalisant une réaction de réduction. Pour cela, le milieu est soumis à des conditions réductrices enzymatiques^[56] ou chimiques^[57].

Acylhydrazone. Les ligations acylhydrazones sont des ligations réversibles mettant en œuvre la condensation d’un aldéhyde avec celle d’un hydrazide. Cette ligation click est chimiosélective. Elle est stabilisée par rapport à l’imine. Ainsi il n’est généralement pas nécessaire de soumettre le système à une étape de réduction.^[57b] La présence d’un groupement électroattracteur sur le carbone en position α de l’hydrazide, est même indispensable pour apporter une dynamique au système et autoriser l’hydrolyse. C’est un carbonyle qui va induire un déplacement électronique, déstabilisant la liaison acylhydrazone et la rendant dynamique. La ligation acylhydrazone reste, malgré tout, suffisamment stable pour être réalisée en milieu aqueux. L’hydrazone, quant à elle, ne présente pas ce carbonyle. Le degré de stabilité de la liaison est dépendant de la nature du substituant de l’azote sp2

impliqué dans la condensation (Figure 9). Selon la nature de l’atome, un déplacement électronique va permettre de réduire les probabilités d’une attaque nucléophile de l’eau. On parle d’effet α.[58] Ce substituant qui est un atome de carbone dans le cas de l’imine, est un azote pour l’hydrazone et un oxygène pour l’oxime. Ces hétéroatomes par le biais d’un effet inductif accepteur, permettent de réduire le caractère basique de l’azote impliqué dans la double liaison. Ce caractère inductif accepte des électrons de l’azote et rend moins électrophile le carbone sp², permettant ainsi de diminuer les risques d’attaque de l’eau sur le carbone plan.

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Figure 9. Ordre de stabilité des ligations issues de la condensation de carbonyles selon la nature du substituant de l’azote impliqué dans la liaison. Avec les flèches noires représentant les déplacements d’électrons et les flèches roses l’effet inductif

Oxime. La ligation oxime est également une réaction de condensation mettant dans ce cas

en jeu une oxyamine et un aldéhyde.^[59] La génération de l’oxime est réalisée avec de bons rendements en milieu aqueux et pour seul produit secondaire, de l’eau. Tout comme les autres condensations décrites, l’oxime est réalisée en l’absence de métaux mais en présence d’une catalyse acide. Le produit obtenu est plus stable que l’imine et l’acylhydrazone (Figure 9).[60] Outre le substituant de l’azote sp2

de la liaison, la présence d’accepteur d’électrons permet de stabiliser l’équilibre thermodynamique en faveur de la formation de l’oxime.[61]

Pour répondre à ce besoin, des aldéhydes aromatiques ou glyoxyliques^[62] sont, depuis quelques années, largement utilisés. Cette ligation a ainsi largement été engagée dans des travaux de recherche nécessitant une bonne chimiosélectivité et notamment pour des réactions sur la surface cellulaire.^[63] La ligation oxime n’est cependant pas bio-orthogonale et ne peut pas être réalisée sélectivement dans le milieu intra-cellulaire.

d. Thiol-maléimide

La ligation thiol-maléimide est une réaction d’addition de type Michael. Elle est formée à partir d’un groupement maléimide et d’un thiol présent notamment sur la chaîne latérale des cystéines. La réaction se caractérise par une cinétique de formation en milieux aqueux relativement rapide et l’absence de produit secondaire généré. L’attaque nucléophile du thiolate sur le maléimide^[64] (Figure 10) requiert une catalyse basique. Cette réaction est chimiosélective.

Figure 10. Mécanisme réactionnel de la réaction de thiol-maléimide par l’attaque du thiolate sur le maléimide

Les groupements maléimides sont susceptibles de présenter des problèmes de sélectivité envers les espèces nucléophiles de type amine ou encore alcool.^[65]

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e. Ponts disulfures

Les liaisons disulfures sont formées à partir d’une réaction d’oxydation de deux groupements thiols. Cette réaction est favorisée en conditions basiques à un pH compris entre 8 et 10. Il est impossible de contrôler si le thiol va réagir avec un réactif identique ou avec le thiol d’un composé de nature différente (Figure 11). Cela peut être utile dans le cas de la chimie combinatoire dynamique ouvrant la possibilité de générer de nouvelles structures, mais peut représenter un inconvénient si l’on souhaite favoriser le produit R₁R₂. Le caractère dynamique des ponts disulfures sous l’action d’un milieu oxydant est alors utile.[66]

Figure 11. Formation de ponts disulfures

f. Ligations orthogonales

Deux ligations orthogonales sont des réactions indépendantes l’une de l’autre, n’interférant pas entre elles. Elles sont cependant, idéalement réalisées dans les mêmes conditions réactionnelles. Ces ligations click orthogonales peuvent être préparées de manière séquentielle ou bien simultanément selon un processus "one-pot". L’avantage offert par l’orthogonalité de certaines ligations click se traduit par une synthèse rapide et efficace de systèmes plurifonctionnels. Ainsi, une réaction d’oxime peut être envisagée en présence d’azotures permettant de fonctionnaliser un châssis peptidique par une cycloaddition azoture-alcyne catalysée au cuivre. Aucun problème de sélectivité n’est relevé puisque les conditions ainsi que les réactifs nécessaires à ces deux ligations sont totalement orthogonaux.^[67] D’autres types de liaisons orthogonales ont fait l’objet de travaux avec par exemple la synthèse de clusters multivalents via des oximes et des thiazolidines,^[68] ou encore la préparation d’oximes et de thioéthers.[69] Finalement, des clusters multivalents fonctionnalisés via quatre ligations orthogonales ont été réalisés. Les fonctionnalisations ont été réalisées successivement par des ligations de type oxime, azoture-alcyne catalysée au cuivre, thiol-ène, thiol-éther ou encore thiol-maléimide (Figure 12).^[70] Par le biais de ces réactions, de nouvelles fonctions peuvent être attribuées aux systèmes ainsi préparés, comme l’apport d’un fluorophore, d’un ligand amenant de la spécificité pour une cible ou encore d’un groupement hydrophile permettant d’offrir une meilleure solubilité et des capacités métabolisables à la molécule (Figure 13).^[70a]

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Figure 12. Plate-forme multivalente fonctionnalisée successivement via la formation de ligations click orthogonales et chimiosélectives

La reconnaissance d’une cible peut être homo- ou hétérotopique. Ainsi, un unique ligand va être engagé dans une reconnaissance homotopique, alors que des ligands de natures différentes peuvent être impliqués dans une complexation hétérotopique.^{[67c; 71]} Dans le cas de ce système tétra-fonctionnalisé, les différents groupements osidiques vont générer des interactions hétérotopiques.

Figure 13. Système multivalent fonctionnalisé par des groupements apportant au composé des propriétés fluorescentes (Alexa 647), un accroissement de l’hydrophilie (sucre) et une capacité de reconnaissance de cellules cancéreuses (RGD) avec f pour la D-phenylalanine

Récemment, des travaux ont permis de développer, en une étape unique, des clusters penta-fonctionnalisés connus pour cibler les tumeurs cancéreuses (Figure 14).^[72] Pour cela, le choix des ligations s’est porté sur la similitude de leur conditions de synthèse, utilisant dans les deux cas du cuivre. D’une part, le châssis est fonctionnalisé via une cycloaddition de type azoture-alcyne, et d’autre part, une nouvelle liaison reposant sur la création d’amide avec l’utilisation d’un thioacide comme intermédiaire. Des dérivés peptidiques ont déjà été préparés avec ce même catalyseur.^[73] La ligation présente cependant l’inconvénient d’être

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sensible à la présence d’autres amines nucléophiles mais ne réagit pas avec les hydroxyles et les thiols.^[74] Ainsi, les composés multivalents sont générés à partir de la combinaison de procédures catalysées par le Cu^II et le Cu^I respectivement pour la préparation de l’amide et la cycloaddition.

Figure 14. Préparation de systèmes penta-fonctionnalisés par auto-assemblage simultané avec différents dérivés thioacides avec f pour la D-phenylalanine

2. Auto-assemblage pour générer des structures multivalentes

Les procédés d'auto-assemblage, basés sur l’organisation de briques moléculaires entre elles, sont de plus en plus utilisés pour le développement de systèmes efficaces pour la reconnaissance de structures biologiques.^[75] Cet auto-assemblage est généré par la formation de liaisons covalentes dynamiques, ou d’interactions faibles supramoléculaires.[76]

a. Auto-assemblage par des interactions supramoléculaires

La chimie supramoléculaire est une des méthodes exploitées ces dernières années pour la construction de systèmes multivalents auto-assemblés.^[77] La multivalence est d'un grand intérêt pour compenser la faible force des liaisons non covalentes des complexes générés par chimie supramoléculaire en milieux aqueux.^{[1b; 4; 8; 11a; 12; 78]} Différentes méthodes de préparation des systèmes multivalents auto-assemblés ont vu le jour ces dernières années :^[76] les liaisons non covalentes telles que les interactions électrostatiques, les liaisons hydrogènes ou encore l’empilement π sont à l’origine de la stabilité des clusters.[8; 78]

Les châssis, générés par des groupements aromatiques, ont par exemple été utilisés pour former des colonnes dynamiques par auto-assemblage.^[79] L’auto-assemblage va induire de la multivalence et permettre d’éventuelles interactions. Des systèmes aromatiques fonctionnalisés par des ligands mannoses spécifiques de la lectine (Con A) ont d’ailleurs montré une reconnaissance accrue par rapport au sucre monovalent (Figure 15).^[79b]

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Figure 15. Auto-assemblage multivalent de systèmes aromatiques, fonctionnalisés par des ligands de type mannose^[79b]

La génération de composés multivalents auto-assemblés peut aussi être effectuée par la coordination de métaux.^[80] Une approche dynamique pour la reconnaissance de protéines via des complexes de fer a notamment été réalisée selon ce principe. Les ligands de bipyridines osidiques sont préformés puis mis en contact avec le Fe^II pour la préparation des complexes (Figure 16).^[81] Le groupement bipyridine est impliqué dans la coordination avec le métal alors que les sucres sont connectés au système par le biais de long espaceur flexible permettant aux saccharides d’être suffisamment distant pour se comporter comme des systèmes individuels pour l’interaction avec le domaine de reconnaissance de la lectine.[82]

La cible protéique, la concanavaline A, est ensuite additionnée au milieu contenant les trois complexes de fer qui vont subir des échanges et favoriser la formation du système le plus stable.

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Figure 16. Auto-assemblage de complexes de Fe^II à partir de trois ligands osidiques bipyridines (de bas en haut : le L-fucose, le D-galactose et le L-mannose) et échange des ligands pour aboutir à une bibliothèque de 10 composés en l’absence de la protéine cible, la concanavaline A[81]

En 2014, des systèmes multivalents générés par auto-assemblage supramoléculaire de ligands osidiques en présence d'atomes de Zn^II ont également vu le jour. Initialement, l’approche d’auto-assemblage a été réalisée en deux temps avec la préparation de liaisons hydrazones entre des résidus de sucres, glucose ou mannose. Les groupements osidiques sont fonctionnalisés par des liaisons hydrazides et un mono- ou un dialdéhyde aromatique. L’étape suivante reposait sur la complexation avec le métal. Deux types de systèmes vont ainsi pouvoir être générés. La coordination du Zn^II avec le mono saccharide hydrazone aboutira à une molécule coin et le ligand divalent permettra la formation d’un système grille [2x2] (Figure 17).^[83] La valence induite par l’auto-assemblage permet ainsi de générer des composés respectivement tétra et octavalent selon la nature de l’aldéhyde. Dans un second temps, l’auto-assemblage est effectué en une seule étape en plaçant les réactifs dans un milieu basique stabilisant la complexation des bipyridines avec le zinc par déprotonation des groupements CONH. Une fois les systèmes préparés, la dynamique de la ligation hydrazone permet d’équilibrer les systèmes vers la formation du complexe stabilisé par les interactions avec la cible biologique, la concanavaline A. Les réactions d’échanges, autorisées par les hydrazones et modulables selon le pH, vont offrir la possibilité de dissocier le complexe et relarguer la protéine. Les études d’association des systèmes auto-assemblés avec la

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biomolécule ont permis d’observer un effet de multivalence favorisant la complexation de la grille au détriment de l’espèce tétravalente (Figure 17).

Figure 17. Auto-assemblage de complexes tétra-nucléaires de zinc de type grille, et de complexes mononucléaires, de type coin, fonctionnalisés par des dérivés osidiques. Avec les sphères rouges pour le Zn²⁺ et les ovales verts pour les sucres modifiés, en haut le dérivé mannose et en bas le glucose

b. Auto-assemblage basé sur la chimie covalente dynamique

L'approche covalente dynamique peut être utilisée pour la préparation de ligations par auto-assemblage. Cet auto-assemblage aboutit à une multivalence induite. Les clusters multivalents construits par auto-assemblage nécessitent de pouvoir être préparés dans des milieux complexes. Afin de favoriser la construction du système, il est courant d’utiliser la cible comme template. La dynamique des ligations est alors indispensable pour conduire de manière efficace à des clusters multivalents.

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En 2013, des polymères cationiques sont construits par auto-assemblage via la formation de ponts disulfures en conditions oxydantes (Figure 18).^[84] Une multivalence est alors induite par la construction d’un système poly-guanidiniums permettant de réaliser de la pénétration cellulaire.

Figure 18. Préparation de polymères cationiques par auto-assemblage covalent dynamique pour la pénétration cellulaire

3. Chimie combinatoire dynamique

La chimie combinatoire dynamique repose sur la préparation de systèmes dynamiques à partir d’une bibliothèque de composés et par le biais de liaisons réversibles.[85] Toutes les combinaisons sont alors possibles, en l’absence de sélectivité. Suite à l’ajout d’une cible, les systèmes peuvent s’adapter jusqu’à atteindre l’équilibre thermodynamique offrant une reconnaissance et une sélectivité optimale.^[86] Dans certain cas, l’effet thermodynamique n’est pas favorable à la complexation et un effet template cinétique peut être plus intéressant pour la stabilité du système. La complexité des milieux contraint en général à travailler sur des bibliothèques constituées d’un nombre réduit de composés.[87] Ces bibliothèques offrent la possibilité de découvrir des molécules non décrites et inattendues.^[88] Ainsi quatre mécanismes différents sont possibles pour effectuer la sélection des composants de la bibliothèque combinatoire dynamique :

 La formation d’interactions non-covalentes intramoléculaires (Figure 19A)

 La formation d’interactions non-covalentes intermoléculaires (Figure 19B)

 L’addition du ligand dans le milieu (Figure 19C)

 L’addition du récepteur dans le milieu (Figure 19D)

La présence d’interactions secondaires avec des cibles biomoléculaires est, par exemple, largement favorable pour la préparation de ligands et de récepteurs.^[16] Un certain nombre de produits ont pu être amplifiés grâce à l’ajout d’une cible ionique[89] ou encore biomoléculaire.^{[86a; 90]} Une même bibliothèque mise en présence de deux cibles différentes a ainsi pu générer deux clusters de nature diverse.^[91]

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Figure 19. Quatre méthodes de sélection de composés d’une bibliothèque combinatoire dynamique. Avec A) la sélection par formation de liaisons non-covalentes intramoléculaires, B) la sélection des constituants par la génération d’interactions non-covalentes intermoléculaires, C) sélection assistée par le ligand ou D) par l’hôte[57b]