Furchgott e Zawadziki, em 1980, mostraram que o endotélio liberava um fator vasodilatador capaz de modular o tônus vascular, o qual denominou de fator de relaxamento derivado do endotélio (EDHF). Em 1987, Palmer e colaboradores demonstraram que o EDHF era o óxido nítrico (NO). O NO é um radical livre inorgânico altamente reativo, em estado gasoso, o que o permite difundir facilmente pelas membranas celulares promovendo vasodilatação. Dentre os componentes vasodilatadores do endotélio, o NO é um dos mais importantes participantes, sendo um componente fundamental na manutenção da homeostase dos vasos, incluindo a modulação do tônus vascular através do seu potente efeito vasodilatador. Este radical livre está envolvido regulação do crescimento celular, além de possuir ação inibitória sobre a adesão e agregação plaquetária (Moncada et al., 19991; Cannon III, 1998) (Figura 1).
Figura 1: Efeitos NO endotelial. A estimulação de receptores endoteliais e o estresse de cisalhamento estimulam a produção do NO, o qual age na própria célula endotelial ou em células adjacentes, como as células musculares lisas, leucócitos e plaquetas encontrados na corrente sanguínea, resultando em numerosos efeitos envolvidos na homeostase vascular. (modificado de Rattmann, 2009).
O NO é produzido nas células endoteliais a partir da oxidação do aminoácido L-arginina, que é transformado então em NO e L-citrulina por ação das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) (Palmer et al., 1987; Moncada et al., 1991; Triggle et al., 2003; Michel & Vanhoutte., 2010). Para gerar NO é necessária a presença de L-arginina, oxigênio, NAD(P)H (adenina dinucleotídeo fosfato), agrupamento heme e tetrahidrobipterina (BH4) (Andrew & Mayer, 1999).
A produção de NO é estimulada pelas catecolaminas, serotonina, bradicinina, histamina, adenosina difosfato (ADP), substância P, agregação plaquetária, angiotensina II e forças mecânicas como o estresse de cisalhamento (Palmer et al., 1987; Moncada et al., 1991; Andrew & Mayer, 1999).
Existem três diferentes isoformas de NOS que podem ser divididas em duas classes funcionais. Uma classe é a constitutiva e inclui a isoforma endotelial (eNOS), e uma neuronal encontrada no sistema nervoso central e periférico
(nNOS). Estas são duas isoformas constitutivas dependentes do complexo Ca+2/calmodulina, produzindo NO em episódios curtos e em baixas concentrações para finalidades fisiológicas (Andrew & Mayer, 1999).
A isoforma endotelial de NOS (eNOS) é a principal fonte de NO nos vasos. Encontra-se na forma de dímero, e é constituída por dois monômeros idênticos de 134kDa. Localiza-se no complexo de Golgi, membrana plasmática, e nas cavélolas plasmalemais (Fleming & Busse, 1999). A eNOS é somente ativada na sua forma dimerizada. A dimerização da eNOS é dada através do agrupamento heme. A formação deste dímero torna possível sua ligação com a tetrahidrobiopterina (BH4), o que proporciona a sua estabilidade (Forstermann et
al., 1994; Andrew & Mayer., 1999; McCabe et al., 2000). Dentre os mecanismos que regulam a atividade da eNOS, podemos destacar mudanças no nível de Ca+2 intracelular, associação do complexo Ca+2/ calmodulina e mudanças intracelulares do pH (Fleming & Busse., 1999).
A quantidade de NO produzida pela eNOS pode ser modulada pela sua fosforilação. Estudos prévios indicam um papel importante da fosforilação da eNOS na regulação de sua atividade e produção de NO (Michel et al., 1993; Dimmeler et al., 1999; Fleming & Busse 2003; Kolluru et al., 2010; Michel & Vanhoutte, 2010; Wang et al., 2010). Esta enzima pode ser fosforilada nos resíduos serina, treonina e tirosina. Dois aminoácidos parecem ser importantes para regulação da atividade da eNOS, um resíduo serina no domínio redutase (na sequência da eNOS humana - Ser1177 e na eNOS bovina - Ser1179) e um resíduo treonina (na sequência da eNOS humana - Thr495 e na eNOS bovina – Thr497) (Fleming et al., 2003; Kolluru et al., 2010 ; Michel & Vanhoutte, 2010).
Em células endoteliais não estimuladas, a Ser1177 encontra-se não fosforilada, no entanto, esta serina pode ser fosforilada após o estresse de cisalhamento, pelo estrogênio, fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), insulina, ou bradicinina (Dimmeler et al. 1999; Fleming & Busse., 2003). Dependendo do estímulo, algumas quinases estão envolvidas nesse processo. O estresse de cisalhamento, por exemplo, pode gerar a fosforilação da Ser1177 através da ativação da proteína serina treonina quinase (Akt) e também da PKA (Dimmeler et al. 1999; Fleming & Busse, 2003). O estrógenio e o VEGF fosforilam principalmente a eNOS via Akt. Já a insulina parece ativar ambas as vias da Akt e da proteína quinase ativada pelo AMPc (AMPK), enquanto que a
fosforilação da Ser1177 induzida pela bradicinina é mediada pela quinase II dependente da calmodulina (CaMKII).( Fleming & Busse, 2003). O resíduo Ser1177 , quando fosforilado, aumenta a atividade da enzima e a produção de NO (Michel et al., 1993; Dimmeler et al., 1999; McCabe et al., 2000; Fleming & Busse, 2003).
O resíduo Thr495 tem papel inibitório da atividade da eNOS e quando fosforilado inibe a ligação da calmodulina ao seu domínio nas células endoteliais (Fleming et al., 2003) A quinase envolvida na fosforilação do resíduo de Thr 495 da eNOS é a PKC. (Fleming & Busse, 2003).
A outra classe de NOS é formada pela isoforma induzível (iNOS), um dímero composto por dois monômeros de 130 kDa. Esta isoforma é regulada em nível transcriptional e a sua ativação é independente da interação Ca+2/calmodulina. Quando sintetizada, na presença L-arginina e NADPH, a iNOS
irá gerar NO por todo o tempo durante o qual a enzima permanecer ativada e em altas concentrações para garantir as atividades antimicrobiana, citostática e imunoregulatória (Forstermann et al., 1994; Andrew & Mayer, 1999). Em situações fisiológicas, a expressão da iNOS não tem grande impacto sobre o sistema cardiovascular. Entretanto, o aumento de sua expressão pode ser induzida em resposta a citocinas e outros mediadores infamatórios (Alvaréz et al., 2008; Sun et al., 2010).
O NO, produzido pelas células endoteliais se difunde rapidamente para as células musculares lisas onde ativa a enzima guanilato ciclase solúvel. Quando ativada, esta enzima promove a formação de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) a partir do trifosfato de guanosina (GTP). O aumento da concentração de GMPc leva à ativação da proteína quinase G (PKG), que atua por diversos mecanismos, promovendo o relaxamento da musculatura lisa vascular (Moncada et al., 1991., Cannon III., 1998).
A PKG ativa canais para K+ dependentes de Ca+2, inibindo assim a entrada de Ca+2 do conteúdo extracelular pelos canais de cálcio dependentes de voltagem, hiperpolarizando a membrana. Esta proteína quinase pode atuar também no retículo sarcoplasmático (SERCA) estimulando a recaptação do Ca+2, na fosforilação da cadeia leve da miosina, tornando-a menos sensível aos íons Ca+2 e no trocador Na+/Ca+2 (estimulando a saída de Ca+2) (Lincoln et al., 2001). O NO promove ainda a ativação direta de canais de K+, levando a
hiperpolarização da célula muscular lisa (Bolontina et al.,1994; Félétou & Vanhoutte, 1999, 2010; Triggle et al., 2003). Todos estes mecanismos contribuem para a diminuição da Ca+2 intracelular, e conseqüentemente no relaxamento do músculo liso vascular (Moncada et al., 1991., Cannon III, 1998; Lincoln et al., 2001;Triggle et al., 2003 ).
Os efeitos mediados pelo NO dependem da expressão da NOS, da biodisponibilidade de fatores que regulam a atividade da NOS e das espécies reativas de oxigênio. Existem vários co-fatores que afetam a síntese do NO, dentre eles a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida – NAD(P)H), tetrahidrobiopterina (BH4), flavina adenina dinucleotídio (FAD) e flavina
mononucleotídio (FMN) (Palmer et al., 1987; Moncada et al., 1991).
A BH4 é um co-fator essencial para NOS, capaz de exercer importante
efeito na função da NOS, incluindo a estabilização de sua estrutura dimérica. A atividade funcional do dímero da eNOS é dependente do número de moléculas de BH4 a ela ligada. A BH4 tem um papel decisivo para o transporte de elétrons
durante a formação do NO. Uma disponibilidade limitada de BH4 para a NOS
resultará em desacoplamento da NOS e aumento na produção dos ânions superóxido (Stroes et al., 1998; Frostermann & Munzel, 2006; Takaya et al., 2007; Charttejee & Catravas, 2008).
A redução da biodisponibilidade de NO é considerado como um dos mais importantes fatores associados com doença vascular (Stroes et al., 1998; Kerr et al., 1999; Frostermann & Munzel, 2006). Um dos principais mecanismos envolvidos na redução na biodisponibilidade de NO, é o aumento dos níveis de ânion superóxido. Nesta situação, o NO reage com o ânion superóxido, formando o peróxinitrito (ONOO-). Esta reação é mais rápida do que a interação do NO com SOD, contribuindo com a formação de um agente oxidante e na diminuição da biodisponibilidade de NO (Stroes et al., 1998; Frostermann & Munzel, 2006; Takaya et al., 2007).
Estudos prévios demonstram que a exposição crônica ao acetato de chumbo induz a disfunção endotelial e reduz a biodisponibilidade de NO devido ao aumento das espécies reativas de oxigênio (EROs) (Ding et al., 1998; Vaziri et al., 1999; 2001).