Les premiers spectromètres commerciaux utilisaient une fréquence micro-onde de 9 GHz, ce qui est encore le cas pour la majorité des spectromètres RPE dits « conventionnels » ou « classiques ». Ils sont également qualifiés de spectromètres « bande X ». D’autre part, le mode de détection le plus répandu est dit « perpendiculaire » ( i.e. le champ magnétique appliquéB0 et le champ magnétiqueB1 de l’onde électromagnétique sont perpendiculaires). Dans ce cas les règles de sélection qui régissent les transitions RPE sont ∆ms =±1, et
0
=
∆mI . Enfin, la cavité dans laquelle est placé l’échantillon est de type résonante, i.e. sa
géométrie peut être adaptée (via la vis d’iris) pour que les ondes y soient stationnaires, ce qui accroît la puissance disponible des micro-ondes.
Cette technique donne accès à un très grand nombre de renseignements sur l’espèce paramagnétique étudiée: degré d’oxydation, nucléarité, géométrie, nombre de coordination et est maintenant utilisée comme une méthode de caractérisation tout aussi indispensable
qu’accessible, dans différents domaines de la chimie mais aussi de la physique. Elle est en particulier très exploitée pour caractériser des sites actifs d’enzymes ou des modèles chimiques, contenant des métaux de transition comme le Cuivre, le Manganèse et le Fe3,5,7,8,9,10,11.
Figure 2- 10: Schéma d'un spectromètre RPE bande X utilisant une détection synchrone avec une modulation à 100kHz. D’après Weil et coll. 19943.
De l’équation fondamentale :
res B
B
g
hν
=
µ
0, Equation 2-32on tire l’existence de deux possibilités pour observer une transition : soit on fixe la fréquence
ν
du rayonnement électromagnétique et l’on fait varier le champ magnétique statiqueB
0, ou alors on fixeB
0 et on fait varier la fréquenceν
. Pour des raisons pratiques c’est la première solution qui est mise en œuvre. La figure 2-10 montre le schéma de principe d’un appareil RPE. Cet appareil est constitué de quatre parties : la source d’onde électromagnétique ; la source du champ statique, le système de modulation et le système de détection. A ceci il faut ajouter un cinquième élément qui est la cavité.La source de l’onde électromagnétique.
Une diode à effet Gunn (anciennement un klystron était utilisé) génère de façon cohérente une onde électromagnétique de fréquence
ν
. Historiquement, les fréquences utilisées dans les tous débuts de la spectroscopie RPE étaient celles utilisées par les radars lors de la seconde guerre mondiale. Celle qui était la plus répandue correspondait àν
=
9,5 GHz, la seconde s’élevait à 35 GHz. On les appelle respectivement bande X et bande Q. Le tableau suivant reprend les différentes fréquences de travail ainsi que leurs dénominations :Bande Fréquence
(GHz)
Longueur d’onde (cm) Champ à g=2 (T)
S 3,2 9,37 0,114 X 9,5 3,19 0,336 Q 35 0,88 1,215 W 95 115 0,32 0,26 3,394 4,108 190 0,15 6 285 0,1 10
Tableau 2- 1: Propriétés des différentes fréquences utilisées en spectroscopie RPE.
Cette fréquence peut varier dans un petit intervalle et est ajustée en début d’expérience. Elle est maintenue à cette valeur grâce à un système d’astreinte : le contrôle automatique de fréquence (AFC) puis le lock offset. Un isolateur sélectionne les ondes qui viennent de la diode à effet Gunn et absorbe les ondes réfléchies de la cavité. Un atténuateur permet le réglage de la puissance de l’onde électromagnétique, cela correspond à un
ajustement de l’amplitude du champ magnétique
B
1. Un guide d’onde permet la transmission sans perte d’énergie de la radiation.La cavité.
Il existe plusieurs types de cavité mais le modèle TE102 est la cavité la plus
couramment utilisée. Dans cette cavité, l’échantillon se trouve au centre, (i.e. là où le champ électrique est minimal et ou le champ magnétique
B
1 est orthogonal au champ statiqueB
0). On commence par créer des ondes stationnaires dans la cavité en ajustant la fréquenceν
de la diode à effet Gunn. Pour minimiser les pertes, la cavité possède des parois en argent recouvertes d’or. La vis d’iris permet d’optimiser la sensibilité de la cavité (ajustement du facteur de qualité pour assurer un minimum de perte au niveau des parois).Le système de détection
Les ondes analysées sont uniquement celles réfléchies par la cavité. L’existence d’un système d’ondes stationnaires au sein de la cavité signifie que dans une situation idéale, ce système d’ondes est confiné dans la cavité. Cependant dans toutes cavités, il existe des fuites et ce sont ces fuites que l’on analyse. On règle le guide d’onde (vis d’iris) pour que, quelle que soit la puissance de la radiation, les fuites de la cavité soient minimales. Quand on applique le champ magnétique et qu’il y a résonance, le système d’ondes stationnaires est modifié et apparaissent les fuites. C’est cette modification que l’on détecte.
La modulation
Pour différentes raisons, la raie RPE peut être très large et présenter un maximum peu élevé. De telles raies sont difficiles à détecter. Pour améliorer la détection de tels signaux on utilise la modulation. Cela consiste à ajouter au champ statique
B
0une composante oscillante de fréquence de 10 à 100 kHz, dont on peut choisir l’amplitude.La figure 2-11 A présente le principe de la modulation. On mesure la différence de courant
a
b
i
i
i=
−
∆
oùi
jcorrespond au courant lorsque le champ appliqué vautB
j. On a2
0 m aB
B
B
=
−
et2
0 m bB
B
B
=
+
. LorsqueB
0devient suffisamment fort pour qu’il y ait absorption de la radiation mais avecB
0〈B
0,res, la différence de courant mesurée est non nulle et positive. LorsqueB
0 se rapproche deB
0,res, c'est-à-dire qu’on se rapproche du maximumd’absorption, la différence de courant diminue, voire s’annule à la résonance. Lorsque
B
0s’éloigne de
B
0,res on a toujours absorption de la radiation mais la différence de courant mesurée devient négative cari
best inférieur ài
a. Enfin lorsqueB
0 est trop grand pour qu’il y ait absorption de la radiation, on a à nouveaui
a=i
b=0
. Si l’on trace la différence de couranten fonction du champ magnétique, on obtient la dérivée première de l’absorption. Les raies peu intenses ou larges sont ainsi détectées.
Cependant la modulation utilisée ne doit pas être excessive, car si la modulation est trop importante, une déformation de la résonance est détectée. Ce phénomène est illustré par la figure 2-11 B
Figure 2- 11: (A) Principe de la modulation. (B) Effet d'une modulation croissante (de 0,1 à 3,2 mT) sur le spectre du 2,2’-phényl-1-picrylhydrazyl (DPPH). D’après Turek3.
L’échantillon
L’échantillon est placé dans un tube en quartz dépourvu d’impuretés paramagnétiques. Un cryostat permet de travailler à basse température. Les solutions doivent être réalisées avec un solvant qui gèle correctement. L’eau une fois gelée ne présente aucun inconvénient particulier, sa constante diélectrique ayant fortement chutée (donc les micro-ondes sont moins absorbées). Ceci est très important pour les échantillons biologiques car la plupart des tampons utilisés sont à base d’eau. Les échantillons de protéines pourront donc être analysés à basse température.
L’amplitude du signal RPE est influencée par la variation de la position angulaire liée à l’anisotropie du signal RPE et par la variation de la position verticale au sein de la cavité. Une
faible variation de la position du tube contenant le matériau peut avoir des répercussions sur l’amplitude du signal RPE.
Conditions d’enregistrement d’un spectre.
En jouant sur les paramètres expérimentaux tels que la puissance des micro-ondes, la modulation d’amplitude, les constantes de temps et le gain, il est possible d’améliorer le rapport signal sur bruit. Cependant, il faut trouver un compromis entre le maximum de sensibilité et la résolution du spectre. Lorsque les échantillons sont stables il est toujours possible d’améliorer le rapport signal sur bruit en augmentant le nombre de scans effectués. Lorsqu’on effectue n scans le rapport signal sur bruit est amélioré par le facteur
n
.On peut également augmenter le rapport signal sur bruit en jouant sur la constante de temps, qui filtre le bruit en intégrant partiellement la réponse du spectromètre. Lorsque la constante de temps augmente, le niveau de bruit s’abaisse. Si la constante de temps choisie est trop longue par rapport à la vitesse de balayage en champ, le signal RPE peut être distordu ou même filtré. S’il est nécessaire d’utiliser une constante de temps longue pour voir un faible signal, la vitesse de balayage doit être diminuée en proportion. Le temps nécessaire d’acquisition du spectre RPE doit être en moyenne dix fois plus long que la constante de temps. Le temps de conversion est le temps nécessaire au convertisseur analogique numérique pour intégrer une valeur de champ donnée avant de passer à la suivante. Si le temps de conversion est trop court, les plus petits signaux sont perdus dans l’étape de numérisation.
Le paramètre température.
Les électrons, excités par l’onde électromagnétique, perdent leur énergie en la transmettant à leur environnement par le processus de relaxation spin-réseau. Ce processus est caractérisé par le temps de relaxation T1. Dans la plupart des complexes de fer, T1 est
particulièrement rapide à température ambiante. Ceci entraîne un grand élargissement des raies RPE. Il est nécessaire de diminuer la température d’enregistrement du spectre RPE à des températures cryogéniques dans le but d’obtenir le spectre RPE d’une métalloprotéine à fer. De plus, en diminuant la température on augmente la taille du signal car on augmente le facteur de Boltzmann. Cependant, si la température est trop basse, la relaxation spin-réseau devient pratiquement inefficace et la taille du signal diminue aux fortes puissances car le nombre d’électrons dans les états fondamental et excité s’égalise, ce qui donne naissance au phénomène de saturation (voir ci-dessous).
La puissance des micro-ondes
La puissance des micro-ondes est un paramètre très important lorsqu’on enregistre un spectre RPE. Elle est à optimiser afin d’avoir le meilleur rapport signal sur bruit. Aux faibles puissances, l’amplitude du signal RPE augmente proportionnellement avec la racine carrée de la puissance. A puissance plus élevée, le signal diminue et l’élargissement de raies apparait. Cet effet est appelé saturation. Afin d’éviter tout phénomène de saturation, on utilise une puissance optimale définie dans la zone de linéarité en dessous de la puissance de saturation. L’équation suivante comporte le paramètre d’homogénéité ε introduit par Innes et Brudvig12. Cette équation permet de tracer la courbe théorique de saturation en puissance et d’obtenir la puissance de saturation.
1
pp sata P
A
P
P
ε=
+
Equation 2-34 ppA
est l’amplitude pic à pic du signal RPE, a un coefficient de proportionnalité,P
sat la puissance des micro-ondes qui caractérise le comportement de saturation du signal et ε le paramètre d’homogénéité variant de ε=0,5 pour des raies inhomogènes (gaussienne) à ε=1,5 pour des raies homogènes (lorentzienne).La position de l’échantillon reste inchangée lors de l’expérience de saturation afin de s’assurer que tous les spectres soient enregistrés dans des conditions identiques.