La spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse (MS) est une technologie qui permet la détermination de la masse moléculaire de composés inconnus ainsi que leur identification et quantification [160]. Un spectromètre de masse se compose de trois principaux constituants, à savoir une source d’ionisation qui permet d’ioniser les molécules, un ou plusieurs analyseurs de masse qui permet la séparation des ions en fonction de leur ratio masse/charge (m/z) et un détecteur qui va permettre de convertir un signal ionique en signal électrique. Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant le rapport m/z des ions détectés en abscisse et l’abondance relative (ar) des ions en ordonnées [161].

1.4.3.1.1. La source d’ionisation

Deux ionisateurs sont principalement utilisés pour l’analyse des protéines ou peptides en spectrométrie de masse, à savoir le MALDI (de l’anglais Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) et l’ESI (de l’anglais Electrospray Ionization). Dans le cas du MALDI (figure 1-18), l’échantillon à analyser est mélangé à une matrice adaptée, capable d’absorber les rayons ultraviolets (UV) [162]. Cette matrice est ajoutée en grande quantité afin d’éviter toutes interactions entre les composés à analyser. Sous l’effet des rayons UV, la matrice va se désorber et se vaporiser, libérant ainsi les molécules d’intérêts et va transmettre à ces molécules ses protons et donc former des ions [162] qui seront sous la forme [M+nH]n+, avec n le plus souvent égale à un [163]

Figure 1-18 Principe de l’ionisation par le MALDI. Adaptée de Przybylski (2016) [128]

Concernant l’ESI, sous la pression d’un gaz de nébulisation, l’échantillon est vaporisé et soumis à un champ électrique important, pouvant correspondre à une différence de potentiel allant de 0,8 kV à 6 kV [164]. Ce champ électrique provoque une accumulation de charges à la surface du liquide. Sous l’effet du mouvement de ces charges, des gouttelettes (mesurant quelques micromètres) sont formées. Par l’application d’un courant d’air chaud, le solvant présent dans ces microgouttelettes s’évapore, ce qui permet la concentration les charges [164]. Ainsi, lorsque la densité de ces charges et les forces de répulsions coulombiennes surpassent les forces de tension de surface, ce qui entraîne une rupture des microgouttelettes, en gouttelettes de plus petites tailles, jusqu'à obtenir finalement des ions en phase gazeuse (figure 1-19) [164].

+ + + + + + + + + + + + + + + + +

Désorption Ionisation Évaporation de la matrice

Laser Matrice

Échantillon Support

Figure 1-19 Principe de l’ionisation par ESI. Tirée de http://mass-spectro.com/electrospray [164]

Après avoir été ionisées, les molécules d’intérêts vont être envoyés vers les analyseurs de masse qui vont permettre la séparation des ions en fonction de leur ratio masse/charge (m/z)

1.4.3.1.2. Les analyseurs de masse.

Dans cette section notre attention sera particulièrement portée sur deux types d’analyseurs, l’analyseur quadripolaires (figure 1-20) et l’analyseur TOF (figure 1-21) qui sont les deux types d’analyseurs utilisés durant ce projet de doctorat.

L’analyseur quadripolaires se compose de quatre électrodes. Les électrodes opposées sont soumises au même potentiel 0 et les deux autres électrodes à un potentiel opposé [165]. Ainsi,

un champ électrostatique quadripolaire est créé entre ces quatre électrodes. La séparation des molécules est basée sur leur stabilité dans l’analyseur [160]. Les molécules possédant un m/z se situant dans intervalle fixé par l’analyseur, oscilleront entre les quatre électrodes jusqu'à atteindre le détecteur, alors que les molécules avec un m/z en dehors de l’intervalle fixé, seront déstabilisées et sortiront de l’analyseur et ne seront donc pas détectées [165].

Figure 1-20 Principe de l’analyseur quadripolaire. Avec une distance entre les deux électrodes de même tension égale à deux fois le rayon r. les électrodes possèdent un potentiel 0 qui est la somme d’un courant continue (U) et d’un courant alternatif (V) de

haute fréquence (). Adaptée de http://mass-spectro.com/quadrupole-mass-analyzer [165]

L’analyseur TOF (Time-Of-Flight, figure 1-21) est basé sur le temps pris par les ions pour parcourir le tube de vol. Ainsi, les molécules reçoivent une même quantité d’énergie [166]. Le temps que met la molécule pour parcourir la distance entre la source et le détecteur est ensuite mesuré ceci permettra de déterminer le ratio m/z de chaque molécule. Les molécules avec un m/z plus petit arriveront les premières au détecteur [166]. Afin d’améliorer la séparation et donc la résolution, un réflectron peut être ajouté. En effet, plus la distance à parcourir est importante, plus la séparation et donc la résolution des molécules sera importante. Cependant, pour des raisons techniques, le tube de vol n’est pas extensible indéfiniment. Ainsi un réflectron, qui se compose de miroirs électrostatiques sur lesquels est appliqué un gradient de tension va permettre de ralentir les ions qui vont pénétrer dans le réflectron, de les arrêter, puis les renvoyer avec la même énergie et donc la même vitesse dans le sens opposé [167]. Les ions feront ainsi un aller-retour dans le tube de vol, et la distance parcourue sera ainsi doublée.

q0 = U - Vcosvt

Figure 1-21 Principe de l’analyseur TOF. Adaptée de http://mass-spectro.com/analyseur-temps-de-vol [167]

Finalement, les ions atteignent le détecteur qui permet de convertir un signal ionique en signal électrique. Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant le rapport m/z des ions détectés en abscisse et l’abondance relative des ions en ordonnées (figure 1-22a) [161].

Figure 1-22 Spectre d’analyse MS (a) Spectre d’analyse MS/MS (b). Adaptée de Costa et al 2011 [161]

Les deux analyseurs (quadripôles et TOF) peuvent être combinés dans un même instrument permettant ainsi des analyses par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) (figure 1-22b) qui

Séparation Spectre MS Spectre MS/MS Spectre MS Analyse MS ou MS/MS Hydrolysat Fragmentation m/z m/z _m/z ar ar ar a) b)

vont une étape plus loin, en fragmentant les ions par collision. À noter qu’il existe différentes combinaisons d’analyseurs possible en MS/MS. Cependant, l’identification des séquences peptidiques réalisées dans ce travail de doctorat a été réalisée par l’analyse des résultats obtenues après injection des échantillons dans un spectromètre de masse contenant un analyseur quadripolaire et un analyseur TOF.