CHAPITRE 4 EXPÉRIMENTATION DU FLOT : FILTRE DE CANNY
4.1 Spécifications et modélisation de l’algorithme
Os nossos resultados indicam que a transição do metabolismo heterotrófico baseado nas reservas nutritivas para o metabolismo autotrófico fotossintetizante nos cotilédones de girassol híbrido Hélio 253 depende da mobilização coordenada dos lipídios e das proteínas de reserva durante o crescimento pós-germinativo inicial. Nesse sentido, os padrões de degradação dessas reservas bem como de partição dos seus produtos sustentam que o processo de mobilização é, pelo menos em parte, regulado pelo mecanismo fonte-dreno. De forma complementar, o paralelismo observado entre a mobilização dos lipídios e das proteínas de reserva pode ser discutido com base em inter-relações recentemente demonstradas entre o metabolismo do carbono e do nitrogênio (EASTMOND et al., 2000; BOREK et al., 2003; LEHMANN e RATAJCZAK, 2008; BOREK e RATAJCZAK, 2010).
A transição para a atividade fotossintética em plântulas de girassol foi evidenciada a partir do 4o dia após a embebição (DAE), com base na acumulação de clorofilas e de carotenoides e na evolução de oxigênio (HEUPEL e KUTSCHERA, 1996). Nossos resultados confirmam que essa transição se dá no 4o DAE, considerando o acúmulo de massa seca (MS) total nas plântulas (Fig. 6D) e o acúmulo de clorofilas totais (CT) (Fig. 6C), de amido (Fig. 6A), de açúcares solúveis totais (AST) (Fig. 7A) e de açúcares não-redutores (ANR) (Fig. 7C) nos cotilédones.
A mobilização coordenada das fontes de carbono e de nitrogênio, antes do estabelecimento da autonomia fotossintética em plântulas de girassol, envolve o mecanismo fonte-dreno. No tocante às fontes de carbono, a mobilização dos ANR (Fig. 7C) e do amido (Fig. 6A) cumpre papel fundamental durante a germinação das sementes nos momentos iniciais do crescimento das plântulas, isto é, até o 2o DAE.
Embora a mobilização dos LN (Fig. 4A) se inicie desde a germinação, esse processo se mostra mais proeminente após a mobilização dos ANR e do amido. Nesse sentido, o mecanismo fonte-dreno pode ser evidenciado ao longo do estabelecimento das plântulas de girassol para as diferentes fontes de carbono, uma vez que a mobilização sequencial dessas reservas nos cotilédones se dá em paralelo com o consumo dos AST no eixo em crescimento (Fig. 7B).
É importante ressaltar que a mobilização dos lipídios de reserva ocorre majoritariamente antes do estabelecimento do aparato fotossintético, pois nossos resultados apontam que, a partir do 5o DAE, a degradação dos LN é diminuída (Fig. 4A). Esses resultados estão de acordo com um estudo prévio utilizando girassol, no qual foi demonstrado que a acumulação de açúcares solúveis nos cotilédones no 5o DAE modula negativamente a atividade da isocitrato liase (ICL), enzima marca- passo da mobilização dos lipídios de reserva (PFEIFFER e KUTSCHERA, 1997).
De maneira semelhante, o mecanismo fonte-dreno parece atuar sobre as fontes de nitrogênio durante o crescimento pós-germinativo em girassol, uma vez que a mobilização das proteínas de reserva nos cotilédones (Fig. 4B), desde a germinação, é acompanhada pelo consumo dos aminoácidos livres totais (AALT) no eixo em crescimento (Fig. 7F). De forma complementar, verificamos que a acumulação dos AALT nos cotilédones (Fig. 7E) ocorreu em um padrão bifásico, corroborado pelo perfil eletroforético das proteínas solúveis (PS) (Fig. 5), o qual mostra a degradação sequencial das cadeias acídicas e básica da heliantinina, globulina 11S de girassol (ŽILIĆ et al., 2010). Além disso, a mobilização das proteínas de reserva foi mais proeminente a partir do 3o DAE (Fig. 4B), acompanhando de modo concomitante a degradação dos lipídios de reserva até o 5o DAE (Fig. 4D). Contudo, após o estabelecimento do aparato fotossintético no 5o
DAE, o processo de mobilização das proteínas continuou até a quase exaustão (Fig. 4B; Fig. 5), provavelmente devido à carência de fontes externas de nitrogênio no meio de cultura.
Baseado em estudos recentes, sugerimos que o paralelismo verificado entre a mobilização dos lipídios e das proteínas de reserva nos cotilédones de girassol até o estabelecimento da atividade fotossintética se deve à existência de vias alternativas que utilizam os produtos de mobilização provenientes de ambas as reservas. Com relação à mobilização dos lipídios de reserva, a assim chamada via clássica envolve a utilização dos produtos de mobilização como precursores da gliconeogênese para a síntese de sacarose a ser enviada para o eixo em crescimento (EASTMOND e GRAHAM, 2001). De maneira complementar, a via clássica de mobilização das proteínas de reserva gera aminoácidos a serem transportados para o eixo em crescimento ou alocados na biossíntese de novo de proteínas nos tecidos de armazenamento (MÜNTZ et al., 2001).
Estudos realizados com Lupinus luteus sugerem que as reservas lipídicas podem ser convertidas não somente em sacarose, mas principalmente em aminoácidos, a partir de duas rotas alternativas à via clássica. Assim, o isocitrato gerado no citosol ou o malato proveniente da mitocôndria podem ser desviados para a biossíntese das amidas de transporte, glutamina e asparagina (BOREK et al., 2003; LEHMANN e RATAJCZAK, 2008; BOREK e RATAJCZAK, 2010). Além disso, outro estudo, utilizando Arabidopisis thaliana como modelo, sugere que as rotas alternativas podem atuar na ausência do ciclo do glioxilato, mantendo a mobilização dos lipídios de reserva quando fontes externas de carbono são ofertadas (EASTMOND et al., 2000).
Nesse sentido, propomos um modelo que integra as vias clássicas de mobilização com as vias alternativas sugeridas na literatura, mostrando que essas inter-relações metabólicas podem estar diretamente relacionadas com a mobilização concomitante dos lipídios e das proteínas de reserva em girassol (Fig. 21). Sugerimos que as vias metabólicas alternativas esquematizadas no modelo podem ser responsáveis pela transformação parcial dos diferentes aminoácidos provenientes da mobilização de proteínas em amidas para envio ao eixo em crescimento, uma vez que as amidas são consideradas as principais formas de transporte de nitrogênio em plantas (HELDT e PIECHULLA, 2011).
Figura 21 - Modelo integrativo proposto para as diferentes vias metabólicas que utilizam os produtos de mobilização dos lipídios e das proteínas. Corpo lipídico (CL), vacúolo de estocagem de proteínas (VEP), glioxissomo (GOX), mitocôndria (MIT), β-oxidação (β-O), ciclo do glioxilato (CG), ciclo de Krebs (CK), proteínas de reserva de sementes (PRS), triacilglicerol (TAG), ácido graxo (AG), aminoácido (AA), trifosfato de adenosina (ATP), α-cetoglutarato (α-KG), glutamato (GLU), glutamina (GLN), oxaloacetato (OAA), aspartato (ASP) e asparagina (ASN).
Além das mobilizações dos lipídios e das proteínas de reserva se mostrarem coordenadas e paralelas nos cotilédones de plântulas de girassol híbrido Hélio 253, durante o crescimento pós-germinativo inicial, os nossos resultados evidenciam que a sacarose fornecida no meio externo modula negativamente a mobilização das proteínas de reserva, assim como a L-glutamina adicionada no meio externo modula negativamente a mobilização das reservas de carbono (LN e amido). De forma complementar, a modulação negativa da mobilização das reservas de carbono e de nitrogênio pelo tratamento com ácido abscísico (ABA) parece envolver um mecanismo diferente daqueles proporcionados por fontes externas de sacarose ou L-glutamina.
Nossos resultados apontam que a adição de sacarose ao meio de cultura modula negativamente a mobilização do amido (Fig. 10D), dos lipídios (Fig. 10A) e das proteínas (Fig. 10B) de reserva nos cotilédones de girassol, pois, já está estabelecido na literatura que a sacarose pode possuir papel tanto como metabólito, quanto como molécula sinalizadora (WIND et al., 2010). Em concordância com os nossos resultados, a sacarose exógena também ocasiona o retardo da mobilização dos lipídios (BOREK et al., 2006; BOREK e NUC, 2011) e das proteínas de reserva (BOREK e RATAJCZAK, 2002) em plântulas de L. luteus, durante o crescimento pós-germinativo.
Curiosamente, os nossos resultados apontam que o efeito modulador da sacarose exógena sobre a mobilização dos lipídios durante o estabelecimento da atividade fotossintética em plântulas de girassol não pode ser atribuído à diminuição da atividade de ICL (Fig. 20A). De fato, a atividade de ICL é aumentada sob tratamentos com sacarose externa em plântulas de L. luteus, e o retardo da mobilização dos lipídios é atribuído à redução da transcrição e da atividade de
lipases (BOREK et al., 2006; BOREK e NUC, 2011). No entanto, durante o crescimento pós-germinativo de plântulas de A. thaliana, o efeito modulador sobre a mobilização dos lipídios parece não ser decorrente da ação direta da sacarose, mas de seus produtos de hidrólise fosforilados (TO et al., 2002).
O retardo da mobilização das proteínas de reserva pela sacarose externa durante o crescimento pós-germinativo inicial em girassol é acompanhado pela acumulação de AALT (Fig. 11E). De fato, a acumulação dos produtos de hidrólise diminui a atividade in vitro de proteases envolvidas na mobilização das proteínas de reserva em Fagopyrum esculentum (DUNAEVSKY e BELOZERSKY, 1989). Assim sendo, nossos resultados indicam que a mobilização das proteínas pode ser retardada por um mecanismo de retroalimentação negativa mediado por aminoácidos nos cotilédones de plântulas de girassol tratadas com sacarose externa.
É possível que o efeito da sacarose externa seja indireto, envolvendo um descompasso entre a mobilização dos lipídios e a das proteínas de reserva. Levando em conta que a sacarose externa pode restringir a degradação dos lipídios devido à repressão das lipases (BOREK et al., 2006; BOREK e NUC, 2011), a acumulação de aminoácidos nos cotilédones de plântulas de girassol tratadas com sacarose pode ser decorrente da desaceleração das vias alternativas que fornecem esqueletos de carbono para a biossíntese de amidas a partir de ácidos graxos (Fig. 21) (BOREK et al., 2003; LEHMANN e RATAJCZAK, 2008; GAUFICHON et al., 2010). Essa hipótese é corroborada pela diminuição da atividade de GS nos cotilédones (Fig. 20B), uma vez que a atividade dessa enzima está relacionada com a biossíntese das amidas de transporte (LEHMANN e RATAJCZAK, 2008; GAUFICHON et al., 2010).
A adição de L-glutamina ao meio de cultura desencadeia efeitos mais drásticos sobre o crescimento do eixo e a mobilização das reservas nutritivas, em comparação com a sacarose exógena, durante o crescimento pós-germinativo inicial em girassol. De fato, o conteúdo de MS do eixo em crescimento é diminuído em 34% na presença de L-glutamina 20 mM (Fig. 13B) e aumentado em 13% com a adição de sacarose 200 mM ao meio externo (Fig. 9B). Além disso, a L-glutamina externa modula negativamente a mobilização do amido (Fig. 14D), dos lipídios (Fig. 14A) e das proteínas (Fig. 14B) de reserva em concentração dez vezes mais baixa que a da sacarose exógena.
Poucos trabalhos abordam o efeito de fontes externas de aminoácidos sobre a mobilização das reservas nutritivas após a germinação das sementes. Em A. thaliana, a adição de peptona ao meio de cultura ocasiona o retardo na mobilização das globulinas (GARCIARRUBIO et al., 1997). De forma adicional, em Dolichos lablab, o retardo da mobilização das proteínas de reserva pelo fornecimento de caseína hidrolisada pode ser devido ao efeito inibidor de aminoácidos sobre a atividade de proteases ácidas (RAMAKRISHNA e RAO, 2005). No entanto, os mecanismos que modulam a mobilização das fontes de carbono na presença de fontes externas de aminoácidos ainda continuam desconhecidos.
Curiosamente, a exposição das plântulas de girassol à L-glutamina externa não proporciona a acumulação de AALT (Fig. 15E), mas ocasiona o aumento do conteúdo de AST (Fig. 15A) e de ANR (Fig. 15C) e a diminuição da atividade de GS (Fig. 20B) nos cotilédones. Neste sentido, é possível que a modulação negativa da mobilização das reservas nutritivas pela L-glutamina exógena pode ser decorrente de um efeito indireto envolvendo a alteração do balanço C:N. De maneira alternativa,
esse mecanismo de modulação pode estar relacionado com a alteração da qualidade, e não da quantidade, do pool de aminoácidos presente nos cotilédones.
Já está claramente estabelecido que as giberelinas (GA) estimulam a mobilização do amido e das proteínas de reserva em cereais após a germinação, induzindo a expressão de α-amilases e proteinases cisteínicas, respectivamente. Além disso, o papel do ácido abscísico (ABA) como antagonista das GA nesse processo também está consolidado na literatura (BEWLEY et al., 2013). Neste trabalho, a adição de GA3 ao meio de cultura não ocasiona alterações nos padrões
de mobilização das reservas nutritivas nos cotilédones (Fig. 18) ou de partição dos seus produtos de hidrólise para o eixo em crescimento (Fig. 19), durante o estabelecimento de plântulas de girassol. Tendo em vista que as GA são produzidas pelo eixo em crescimento e transportadas para os tecidos de armazenamento após a germinação (BEWLEY et al., 2013), é possível que o conteúdo endógeno das GA nos cotilédones de girassol seja suficientemente elevado para mascarar o efeito do GA3 adicionado ao meio externo em baixa concentração (50 µM).
Em contraste, a adição de ABA ao meio de cultura modula negativamente a mobilização dos lipídios (Fig. 18A) e das proteínas de reserva (Fig. 18B), mas causa a diminuição do conteúdo de amido (Fig. 18D) nos cotilédones de plântulas de girassol durante o crescimento pós-germinativo. Embora alguns trabalhos indiquem que o ABA afeta a mobilização dos lipídios restringindo a expressão de enzimas da beta-oxidação e da malato sintase (PRITCHARD et al., 2002) ou a atividade da ICL (MARRIOTT e NORTHCOTE, 1977; FINKELSTEIN e LYNCH, 2000), o retardo da mobilização dos lipídios nas plântulas de girassol tratadas com ABA exógeno não pode ser atribuído à alteração da atividade de ICL (Fig. 20A).
Algumas evidências indicam que o ABA é capaz de restringir a mobilização das proteínas de reserva após a germinação (GARCIARRUBIO et al., 1997; TONINI et al., 2010), modulando negativamente a atividade de proteases (BARDUCHE et al., 1999). Em plântulas de girassol, sugerimos que o retardo da mobilização das proteínas nos cotilédones (Fig. 18B) pode ser decorrente do efeito do ABA exógeno sobre a mobilização dos lipídios. De fato, o atraso da degradação dos lipídios (Fig. 18A) induzido por ABA é corroborado pela diminuição do conteúdo de AST nos cotilédones (Fig. 19A) e no eixo em crescimento (Fig. 19B). Em contraponto, a acumulação de PS no eixo (Fig. 18C) e de AALT, em ambas as partes (Fig. 19E e F), não favorecem a hipótese de que o ABA exógeno modula diretamente a mobilização das proteínas nos cotilédones de plântulas girassol.
Já está estabelecido na literatura que as auxinas apresentam um papel indutor no crescimento das plântulas, relacionado com todos os aspectos do desenvolvimento vegetal (SIMON e PETRÁŠEK, 2011). Contudo, nossos dados indicam que a aplicação externa de ácido indolbutírico (IBA) ocasiona retardo da mobilização das reservas em plântulas de girassol, demonstrado pelo aumento dos conteúdos de MS (Fig. 17A), de LN e de PS (Fig. 18A e B) nos cotilédones em paralelo com a diminuição do conteúdo de MS no eixo em crescimento (Fig. 17B). De forma complementar, verificamos uma alteração morfológica da parte radicular das plântulas tratadas com IBA (Fig. 16) e um acúmulo de PS no eixo em crescimento (Fig. 18C).
Em relação ao retardo do crescimento, um trabalho utilizando Aechmea blanchetiana demonstrou que a aplicação externa de IBA em baixas e altas concentrações ocasiona indução e retardo, nessa ordem, do desenvolvimento (CHU et al., 2010). Quanto ao efeito morfológico, já é sabido que as auxinas auxiliam na
indução da formação de raízes laterais e de calos (INGENSIEP, 1982; CHENG et al., 1992; WOODWARD e BARTEL, 2005). Nesse sentido, o acúmulo de proteínas solúveis no eixo em crescimento está associado ao fato de as auxinas induzirem a formação de raízes laterais e tem sido relacionado com um aumento na síntese de enzimas durante o processo de regeneração de raízes (HUSEN, 2008). Assim, é possível que a concentração de IBA utilizada no presente trabalho seja muito elevada para promover o desenvolvimento das plântulas de girassol.
A utilização do girassol como espécie modelo para estudar os mecanismos de mobilização de reservas em dicotiledôneas oleaginosas mostrou-se uma ótima opção na medida em que propiciou um sistema experimental fácil e rápido, gerando resultados reprodutíveis e evidentes.