MATERIELS ET METHODES
I. Souches bactériennes, plasmides, oligonucléotides et conditions de culture
L’étude est réalisée principalement avec la souche E. faecalis JH2-2 (217) issue de l’isolat clinique E. faecalis JH2 (218) suite à l’action d’un mutagène chimique. Les caractéristiques des différentes souches bactériennes et des principaux mutants d’E. faecalis JH2-2 étudiés au cours de ce travail sont décrites dans le Tableau 2. La souche JH2-2 présente, en comparaison à la souche séquencée d'E. faecalis V583 (1), une meilleure aptitude à la transformation et une sensibilité à l'érythromycine, permettant l'utilisation d'une gamme d'outils moléculaires plus importante, cette souche est de plus dépourvue de plasmides.
La souche E. coli DH53 est utilisée lors des étapes de clonage dans le vecteur d’expression pQE-30 (Qiagen). La souche E. coli M15 est utilisée pour la surproduction de protéine de fusion avec le système QIAexpress (Qiagen).
Lors d’expériences d’α-complémentation, le
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside (X-Gal) et
l’isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) sont additionnés au milieu gélosé à des concentrations de 50 µg/mlet 1 mM, respectivement.
Les milieux gélosés sont obtenus par l’ajout de 15 g/l de bactoagar dans les milieux liquides.
Les souches bactériennes sont conservées par congélation à -80 °C après addition dans le milieu de culture de glycérol à une concentration finale de 15 % (v/v).
L’ensemble des plasmides utilisés dans le cadre de cette étude est récapitulé dans le Tableau 3 et les différentes amorces et leur utilisation sont référencées dans le Tableau 4.
La croissance des différentes souches étudiées au cours de ce travail a été estimée par turbidimétrie par la mesure de la densité optique à 600 nm (DO600nm) à l’aide du Biophotometer (Eppendorf) de suspensions bactériennes, obtenues en ensemençant à 1 %, 10 ml du milieu de culture adéquat à l’aide de cultures prises en phase stationnaires de croissance.
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Tableau 2 : Souches bactériennes utilisées au cours de cette étude.
Tableau 3 : Plasmides utilisés au cours de cette étude.
Plasmides Description Source ou référence
pUCB300 (220)
pUCB300-EF2224 pUCB300 + fragment interne du gène EF2224 Cette étude
pUCB300-EF3054 pUCB300 + fragment interne du gène EF3054 Cette étude
pQE31 Qiagen
pQE31+EF1843 pQE31 + ORF du gène EF1843 sans peptide signal Cette étude
pMAD (219)
pMAD+pgdA pMAD + gène EF1843 avec parties amont et aval Cette étude
pMAD+5pgdA pMAD + gène EF1843 délété Cette étude
pMAD+EF0783 pMAD + gène EF0783 avec parties amont et aval Cette étude
pMAD+5EF0783 pMAD + gène EF0783 délété Cette étude
Souches bactériennes Génotype et plasmides Source ou référence
E. coli
DH53 supE44 1lacU169 (280lacZ1M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 Invitrogen
DH53(pQE31) pQE31 Souche du laboratoire
M15 recA+ uvr+ F- mtl gal ara lac Qiagen
M15(pREP4) pREP4 Qiagen
M15(pREP4 ; pQE31-EF1843) pREP4 ; pQE31+EF1843 Cette étude top10F' F´[lacIq Tn10 (TetR)] mcrA 5(mrr-hsdRMS-mcrBC) 680lacZ5M15 5lacX74
recA1 araD139 5(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
Invitrogen
top10F'(pMAD) pMAD transformé dans la souche top10F' (219) top10F'(pMAD+5EF1843) pMAD+5EF1843 transformé dans la souche top10F' Cette étude top10F'(pMAD+5EF0783) pMAD+5EF0783 transformé dans la souche top10F' Cette étude top10F'(pUCB300) pUCB300 transformé dans la souche top10F' (220) top10F'(pUCB300-EF2224) pUCB300-EF2224 transformé dans la souche top10F' Cette étude top10F'(pUCB300-EF3054) pUCB300-EF3054 transformé dans la souche top10F' Cette étude
E. faecalis
JH2-2 FusR RifR, souche dépourvue de plasmide (218)
∆EF2224 mutant insertionel du gène EF2224 dans la souche JH2-2 Cette étude
∆EF3054 mutant insertionel du gène EF3054 dans la souche JH2-2 Cette étude
∆EF1843 mutant de délétion du gène EF1843 dans la souche JH2-2 Cette étude
∆EF0783 mutant de délétion du gène EF0783 dans la souche JH2-2 Cette étude
∆ΕF1843−∆ΕF0783 mutant de délétion des gènes ∆EF1843-∆EF0783 dans la souche JH2-2 Cette étude ∆sigV mutant ponctuel du gène ∆sigV dans la souche JH2-2 (221)
56 Tableau 4 : Amorces utilisées au cours de ce travail.
Nom Séquence (5’-3’)a Sites de
restriction
Gène ou plasmide
identifié Commentaire Pgd17 AAGTATAACGTCCACGCAACT
EF1843
Criblage de la présence des gènes dans des souche environnementales Pgd9 CTTTAGTGCTGCAGTTGCTCTA LH50 TGAATCAGACAGCAAATAGCAAG EF0783 LH52 GCGCTTCAACTGCCAATGAC LH66 TATGCACGTCGTAGTCAACG EF0590 LH67 TTTCCTTACTGCGATCCCAG Pgd19 CAACATTGACTGCAGACCAGAAAT PstI
EF1843 Clonage du gène EF1843 dans le plasmide pQE31 LH 20 ACAAGTAAAAAGGATCCTACTACGC BamHI
Pgd10 CAATTTAGAGGAATTCTAAAACTTC EcoRI
EF1843 Délétion du gène EF1843 Pgd15 CTACTACAGTCGACAGAAATGC SalI
Pgd14 GAATTTTTAGTCGACTGTCTGCG SalI Pgd18 GTATGGTGGCATGCCTTCTTGAT SphI
LH 21 TGTAAAACCATGGCCAGTG NcoI
EF1843 Vérification de la délétion du gène EF1843
LH 22 TACACTTTATGGATCCGGCTCG BamHI
LH37 CAAACGAATTCAAGAGACTGACG EcoRI
EF0783 Délétion du gène EF0783
LH38 CGCAACAAGTCGACAATAAGA SalI
LH39 AGTCAAGTCGACAAAAAATACG SalI
LH40 AAGCCGGGATCCCCTTGAGGG BamHI
LH41 TCGACCAGATTTAACTGTCCG
EF0783 Vérification de la délétion du gène EF0783
LH42 TTTCCAGAAAAAGCACCGCC PU GTAAAACGACGGCCAGT
pUCB300 Vérification de la présence d'insert dans le plasmide pUCB300 PR CAGGAAACAGCTATGAC
EF2224A AGATAAAGAGCTCGGTTTCG SacI
EF2224 Clonage de EF2224 dans le pUCB300 EF2224B CCTTTATATCTAGATGCACTC XbaI
LH11 TTAAGTGAAGAGCGAGGACC
EF2224 Vérification de l'interruption du gène EF2224
LH12 AGATTTGTTCCGTAAGCAGG
EF3054A ATGGCGCTCTAGACTGGTT XbaI
EF3054 Clonage de EF3054 dans le pUCB300 EF3054B TTTCTCTAAGCTTCCAATCTG HindIII
LH7 AAGTAGGGCTCTTTTTGTAGC
EF3054 Vérification de l'interruption du gène EF3054
LH8 CACTTCCCAATAGGTGATTCC LH54 GCGATACCCAGGAGGTCATA
EF1843
Pour RT PCR Sybr® Green LH55 ACCATCGCATTCCAGTCAAT LH56 ACCTTCGTGAAAAAGGGACA EF0783 LH57 GTTGCGCACTTTTAGCGTTT LH58 GTCGGCCAATTATGATTGATG EF2678 LH59 GCAATTCCAGTTGTCGAACAT LH60 CGAAAGAAGATGCCTTGGAT EF3180 (sigV) LH61 AAGAACCACGCGTCAAAATC PgdA-1 CAACACTAAAGAAATACAAGCGGAAA EF1843
Amorces pour RT PCR TaqMan® PgdA-2 ACTGTAGTAGGCTGTCTGTCTAAC
PgdA-Probe FAM- CGCATCTCCAACCATCGCATTCCA-TAMRA Sonde pour RT PCR TaqMan®
a
Les bases soulignées correspondent aux sites de restriction. FAM, 6-carboxyfluorescein ; TAMRA, 6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine.
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II. Méthodes d'analyses physiologiques
II. 1. Tests de sensibilité au lysozyme
Après des essais préliminaires, nous avons retenu pour différencier les niveaux de sensibilité au lysozyme de mutants dérivant de la souche d'E. faecalis JH2-2 les conditions suivantes : les tests de sensibilité ont été effectués sur 3 ml de milieu Mueller Hinton agar (pH 7,4), contenant différentes concentrations de lysozyme (0, 5, 20, 40 et 60 mg/ml) et du tellurite de potassium à 0,8 µg/ml, disposé dans une plaque de culture compartimentée 5x5. Pour chaque souche, 10 µl d'une suspension bactérienne contenant 106 cellules/ml ont été déposés sur les différents milieux. Les zones de croissance ont été observées après 48 h d'incubation à 37 °C. La différence de couleur observée entre la première colonne et les suivantes est due à la turbidité causée par la présence de lysozyme. Le tellurite de potassium a été ajouté afin d'accroître le contraste entre les colonies et le milieu. Les mêmes tests ont été conduits sur des milieux de cultures dépourvus de tellurite de potassium.
II. 2. Criblage d'une banque de mutants aléatoires d’E. faecalis vis-à-vis de la sensibilité au lysozyme
La banque de mutants insertionnels de la souche JH2-2 d'E. faecalis utilisée dans cette étude est celle décrite par Le Breton et al. (222). Brièvement, des fragments d'ADN chromosomiques de 0,2 à 1,5 kb générés par une digestion partielle par l'endonucléase AluI ont été clonés dans le plasmide pORI19 (dérivé de pWV01 Ori+ RepA+) dans la souche "helper" RepA+ d'E. coli EC101 (223) afin d'obtenir une banque d'environ 37200 plasmides recombinants. Un mélange de ces plasmides a ensuite été transformé dans une souche d'E.
faecalis ayant préalablement reçu le vecteur pVE6007 (plasmide pG+host3 dérivé Ori+ RepATS du pWV01) (224). Les clones ont été incubés à 30 °C en milieu GM17 contenant de l'érythromycine et du chloramphénicol (la protéine thermosensible RepATS est active à 30 °C, permettant la réplication des plasmides recombinants pG+host3 et pORI19). Les cellules ont ensuite été transférées dans du milieu GM17 contenant de l'érythromycine et incubées à 42 °C afin d'inactiver la protéine RepATS et favorisant ainsi la perte du pG+host3 et l'intégration des plasmides pORI19 recombinants. 9 600 mutants intégratifs d’E. faecalis ont été repiqués sur microplaques 96 puits dans 200 7l de milieu GM17 contenant de l’Erythromycine et cultivés à 37 °C jusqu’à atteindre la phase stationnaire de croissance.
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La recherche de mutants affectés dans la capacité à résister à l'action du lysozyme a été faite en ensemençant, à l’aide des cultures précédentes, des boîtes de Petri contenant du milieu MH supplémenté de lysozyme à 20 mg/ml et en cultivant les mutants 16 h à 37 °C. La recherche de clones ayant perdu la capacité de se développer en présence de lysozyme a été effectuée visuellement.
II. 3. Survie en macrophages de souris
Les expériences de survie en macrophages ont été réalisées par l'équipe de M. Sanguinetti de l’Institut de Microbiologie, de l'Université Catholique du Sacré Cœur, à Rome.
La survie d’E. faecalis JH2-2 et des différents mutants en macrophages de péritoine de souris est estimée en utilisant un modèle d’infection in vivo-in vitro (37). Les différentes souches d’E. faecalis sont cultivées en aérobiose à 37 °C en milieu BHI pendant 16 h tandis qu’E. coli DH5α (utilisée comme contrôle négatif) est cultivée en bouillon LB. Les bactéries sont ensuite récupérées par centrifugation et resuspendues dans un tampon phosphate pour injection. Des souris mâles de type BALB/c âgées de 10 semaines (Harlan Italy S.r.l., San Pietro al Natisone, Udine, Italy) sont infectées avec 107 à 108 cellules par injection intra-péritonéale. Après 6 h d’incubation, les macrophages sont collectés par lavage du péritoine, centrifugés, et repris dans un milieu « Dulbecco’s modified Eagle’s » (HEPES 10 mM, glutamine 2 mM, sérum fœtal bovin 10 % et acides aminés non essentiels) supplémenté avec de la vancomycine (10 µg/ml) et de la gentamicine (150 µg/ml) afin d’éliminer les bactéries extracellulaires. Les suspensions cellulaires sont réparties en boîtes de culture et incubées à 37 °C en présence de 5 % de CO2 pendant 2 h. Puis, les macrophages sont lavés, et lysés par ajout d’un détergent. Après dilution en bouillon BHI, les lysats sont ensemencés sur milieu BHI solide (agar) pour la quantification des bactéries intra-cellulaires viables. Cette procédure est réalisée 8, 24, 48 et 72 h après l’infection.
II. 4. Tests d'immobilisation en milieu semi-liquide
Les tests d'immobilisation ont été réalisés dans du milieu GM17 contenant 0,04 % d'agar (225, 226). Deux types d'ensemencement ont été réalisés, soit en surface, par dépôt d'une goutte de culture de nuit à la surface du milieu, soit en masse par ensemencent de 100 µ L d'une dilution 10-6 d'une culture de nuit. Les observations ont été effectuées à intervalles réguliers pendant 72 H.
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II. 5. Tests de sensibilité aux antibiotiques
La détermination de la sensibilité aux antibiotiques a été réalisée selon la méthode de diffusion en gélose Mueller-Hinton avec des disques d’antibiotiques (Biorad).
Ces tests consistent à déposer à la surface d'une gélose Mueller-Hinton des disques de papier buvard imprégnés des différents antibiotiques testés. Chaque antibiotique diffuse au sein de la gélose et détermine des concentrations inversement proportionnelles à la distance par rapport au disque. Avant de déposer les disques, on ensemence uniformément la surface de la gélose avec le micro-organisme à étudier. L'inoculum doit être dense (opacité équivalente à 0,5 sur l'échelle de Mac Farland). Après une incubation de 24 à 48 heures à 37 °C, les disques apparaissent entourés d'une zone d'inhibition dont le diamètre permet d'estimer et de comparer les concentrations minimales d'inhibition. Une batterie de 13 antibiotiques a été généralement utilisée : l'amoxicilline, l'ampicilline, la céfalotine, le chloramphénicol, l'érythromycine, la kanamycine, l'oxacilline, la pénicilline, la spiramycine, la streptomycine, les sulfamides, la tétracycline, et les triméthoprime-sulfamides