Os derivados de isatinas-tiossemicarbazonas são moléculas bioativas compostas por grupos químicos, que conseguem atuar juntos para melhorar o arsenal terapêutico (MORAES GOMES et al, 2016; ALMASI et al., 2019). Muitas condições clínicas requerem agentes terapêuticos que atuam de forma ampla, ou seja, por vários mecanismos e em vários sistemas, de forma eficaz e segura (SHETTY et al, 2018).
Neste estudo, as doses do derivado de isatina-tiossemicarbazona PA-Int6 avaliadas obedeceram aos limites de solubilidade do composto (MORAES GOMES et al, 2016), assim como os protocolos de toxidade da OECD (nº 423, 407 e 408). A escolha da via de administração foi baseada na comodidade terapêutica, tendo como expectativa o desenvolvimento de um medicamento via oral.
Inicialmente deve-se realizar uma triagem farmacológica comportamental, que fornece uma investigação geral sobre a natureza farmacológica e toxicológica de uma substância desconhecida com possíveis ações no Sistema Nervoso Central (SNC) e efeitos autonômicos (ALMEIDA, 2006). Essas observações são necessárias para evitar confundi-las com respostas de outros testes que também avaliam indiretamente o comportamento do animal (FERREIRA-PINTO et al, 2018). Por isso, uma avaliação da maior dose de PA-Int6 (5,0 mg/Kg) para a atividade neural central foi desenvolvida através dos testes comportamentais Campo aberto e Rotarod.
Os resultados obtidos com esses testes não demonstraram alterações significativas em nenhuma das análises, ou seja, o composto não interferiu nas variáveis de locomoção espontânea (Figura 13A e B) e nem nas variáveis de coordenação motora (Figura 14A e B). Desta forma, foi possível continuar com avaliações mais detalhadas desse derivado, abrangendo para testes de toxicidade e de eficácia.
A avaliação da toxidade aguda do PA-Int6 tinha a finalidade de investigar qualquer efeito imediato causado pelo tratamento com dose única de 5,0 mg/Kg, assim como seus possíveis efeitos durante o período de observação. Na avaliação da toxicidade subcrônica foram pesquisados efeitos adversos acumulativos, por
tratamento diário (30 dias) com três doses do PA-Int6: 1,0 mg/Kg, 2,5 mg/Kg e 5,0 mg/Kg. Essas doses foram baseadas, inicialmente, a partir da avaliação da toxicidade aguda deste composto, a qual não demonstrou nenhum efeito de toxicidade observável.
Ao avaliar o peso corpóreo, não ocorreu variação que chegasse a 20%, o que seria um indicativo de efeito tóxico segundo a OECD (OECD, 2002; OECD, 2008; OECD, 2018). Com relação ao consumo de ração e água, os animais comportaram- se de acordo com o esperado para a espécie e, portanto, não houve influência do uso de PA-Int6 no metabolismo dos mesmos (CHAMPY et al, 2004; RESTEL et al, 2014).
Comparações entre resultados de estudos que envolvem animais são dificultadas devido à falta de informações precisas, como linhagens, sexo, idade e dieta dos mesmos. Tudo isso, além de fatores ambientais e manuseio, pode interferir na fisiologia deles e gerar variações. Desta forma, os valores de referência para parâmetros hematológicos e bioquímicos podem não representar precisamente a população ou espécie utilizada em estudos diferentes e as interpretações devem ser realizadas cuidadosamente (FERNÁNDEZ et al., 2010; MATIDA et al., 2015; SPINELLI et al., 2014). Embora tenham sido constatadas diferenças entre alguns autores, a comparação da maioria dos resultados deste trabalho com aqueles descritos na literatura indica que os parâmetros fisiológicos encontrados aqui estão dentro da faixa de variação normal para a espécie (BRANCO et al., 2011; MATIDA et al., 2015; RESTEL et al., 2014; SANTOS et a., 2016; SERFILIPPI et al., 2003).
O sangue e o tecido hematopoiético, assim como o fígado e os rins, são órgãos-alvo que merecem um exame minucioso em avaliações de segurança não clínicas e clínicas. A importância do exame de sangue em estudos de toxicidade é uma consequência da exposição direta dos componentes celulares e humorais sanguíneos a compostos que podem exercer efeitos hematotóxicos por diferentes ações e mecanismos (YORK, 2017). A avaliação hematológica representa uma importante medida sobre o estado de saúde dos animais e é descrita na literatura por ter alta correlação em predizer toxicidade humana, ou seja, compostos que alteram os parâmetros hematológicos em animais tem grande possibilidade de alterar os mesmos parâmetros em humanos (OLSON et al., 2000). O hemograma é a base da avaliação do sistema hematopoiético em estudos de toxicidade não clínica, sendo esse sistema um dos alvos mais sensíveis a compostos tóxicos (GILL,
et al., 2018). Entretanto, neste estudo não foram encontradas alterações significativas nos hemogramas das avaliações de toxicidade aguda (Tabela 2) e subcrônica (Tabelas 6 e 7). Isso demonstra que o PA-Int6 não causou quaisquer efeitos tóxicos sobre a medula óssea e homeostasia do sistema sanguíneo, assim como nas células associadas à inflamação ou lesão presentes no sangue, seja após tratamento de dose única ou após tratamento diário por 30 dias (para as três doses).
A composição bioquímica do sangue, por sua vez, reflete a situação metabólica dos tecidos animais e, por isso, sua análise é uma ferramenta necessária para avaliar lesões teciduais, transtornos no funcionamento de órgãos, adaptação diante de desafios nutricionais, fisiológicos e desequilíbrios metabólicos (SILVA; HARTER; RESENDE, 2018). Quanto a tudo isso, o derivado de isatina-tiossemicarbazona PA- Int6 mostrou-se seguro, apresentando apenas sinais reversíveis e característicos da fisiologia da espécie (LINK et al., 2016; MARTÍNEZ et al., 2013). Poucas alterações nos parâmetros bioquímicos avaliados foram observadas, mas nada que comprometesse o metabolismo geral dos animais.
O tratamento com dose única de PA-Int6 (5,0 mg/Kg) apresentou alteração significativa em apenas um parâmetro bioquímico (Tabela 3). Os triglicerídeos dos animais machos tratados com esse composto apresentaram-se aumentados, com relação aos animais tratados com o veículo. Já após a avaliação da toxicidade subcrônica, poucos parâmetros demonstraram alterações relevantes, tantos entre machos quanto entre fêmeas. Os machos que receberam a dose intermediária (PA- Int6 2,5 mg/Kg) tiveram aumento de albumina e aqueles que receberam a maior dose (PA-Int6 5,0 mg/Kg) tiveram aumento de albumina e proteínas totais. As fêmeas tratadas com PA-Int6 1,0 mg/Kg (menor dose) também tiveram albumina aumentada e aquelas tratadas com PA-Int6 5,0 mg/Kg apresentaram triglicerídeos elevados (Tabela 8).
Os triglicerídeos, juntamente com o colesterol, são os lipídios mais frequentemente quantificados no sangue. São adquiridos pela ingestão alimentar, assim como também sintetizados pelo fígado (fonte endógena) e representam uma importante fonte de energia para o organismo. No sangue, são transportados pelas lipoproteínas, que tem composição semelhante em animais e em humanos (YORK, 2017). Diferenças no metabolismo lipídico entre espécies causam dificuldades em correlacionar os efeitos lipídicos em modelos animais com potenciais efeitos em humanos. Pequenas mudanças nas concentrações séricas de colesterol e
triglicerídeos, tanto aumentos quanto diminuições, são achados relativamente frequentes nos estudos de toxicidade. Essas alterações são, geralmente, reflexos de eventos metabólicos gerais, ao invés de ser consequência da toxicidade de um composto, e acredita-se que não afetam negativamente a saúde dos animais (EVANS, 2009; STOCKHAM; SCOTT, 2008). Quando a gordura é mobilizada para satisfazer as necessidades energéticas devido à inanição, má absorção ou digestão deficiente, os triglicerídeos séricos geralmente aumentam (HALL; EVERDS, 2007). Entretanto, esses aumentos também podem estar relacionados à predisposição dos animais à aterosclerose e doenças coronarianas (OMOTOSO et al., 2017; PUNDIR; NARWAL, 2018) ou a distúrbios no fígado (GOSSELIN; RAMAIAH; EARL, 2009). Na ausência de outros dados que suportem esses fatos, como alterações nos níveis de colesterol e enzimas hepáticas, não é possível atribuir este efeito ao PA-Int6.
As proteínas plasmáticas são principalmente sintetizadas no fígado (albumina e globulinas), mas também são produzidas pelo sistema imunológico (imunoglobulinas) e órgãos endócrinos (hormônios proteicos). Elas podem ser classificadas de acordo com suas atividades em: enzimas, fatores de coagulação, fatores do complemento, hormônios, proteínas de fase aguda e proteínas de transporte. Coletivamente, fornecem suporte nutricional, determinam a pressão osmótica coloidal e estão envolvidas na manutenção do equilíbrio ácido-base. O soro, quando utilizado como amostra para análise em laboratório, contém todas as proteínas plasmáticas, com exceção daquelas envolvidas no processo de coagulação (YORK, 2017).
Com relação à albumina, esta contribui aproximadamente com 40-60% do total de proteínas plasmáticas em animais, sendo o principal determinante da pressão osmótica coloidal e considerado o marcador mais comumente utilizado para avaliar o estado nutricional dos seres vivos. É responsável pelo transporte de várias substâncias fisiológicas (bilirrubina, vitaminas, hormônios) que são normalmente insolúveis ou pouco solúveis em fluidos aquosos, além de também ligar-se a substâncias exógenas (fármacos) (FONTOURA et al., 2006; GUPTA; LIS, 2010; SANTOS et al., 2004; WATANABE, et al., 2010; YORK, 2017).
Em estudos de toxicidade, aumentos na concentração de proteínas totais (hiperproteinemia) e albumina podem ser consequências de desidratação nos animais. Isso pode estar associado a perdas de fluidos no trato gastrointestinal (vômitos, diarreia e salivação excessiva), poliúria ou diminuição do consumo de
água. Em roedores, um menor consumo de alimentos pode contribuir com um menor consumo de água e consequentemente apresentar desidratação relativa. A hiperproteinemia também pode estar associada com respostas inflamatórias, levando à produção de proteínas de fase aguda e imunoglobulinas (HALL; EVERDS, 2007). Neste estudo, não foram observados sinais clínicos que pudessem indicar desidratação nos animais avaliados, pois o consumo de água não foi alterado e não ocorreram episódios de vômito ou diarreia durante o período experimental. Também não foram obtidos dados em outros parâmetros (hemograma e histopatologia) que correspondessem à presença de algum processo inflamatório decorrente do uso do PA-Int6. Desta forma, o aumento de proteínas totais e albumina em alguns animais pode estar relacionado à fisiologia da espécie, assim como ao tratamento estatístico com grupos amostrais tão pequenos.
A análise histopatológica é essencial na avaliação do perfil de segurança de um composto desconhecido (FAQI, 2013). Na avaliação da toxicidade aguda do PA- Int6 não houve diferenças entre os achados histológicos encontrados nos animais dos grupos Testes e nos animais dos grupos Controles. No tecido hepático foram encontrados, de forma discreta, os seguintes achados: esteatose hepática, degeneração hidrópica, hematopoiese extramedular e apoptose pontual (Figura 17). A congestão foi a única alteração encontrada no tecido renal de todos os grupos (Figura 18). Trata-se de um achado bastante inespecífico e, não estando associado com alterações de marcadores bioquímicos renais, provavelmente não está relacionado ao uso do PA-Int6.
Na avaliação da toxicidade subcrônica apenas a presença de hematopoiese extramedular nos animais tratados com PA-Int6 de 2,5 mg/Kg e PA-Int6 de 5,0 mg/Kg foi diferente dos animais tratados com veículo, que só apresentaram esteatose e degeneração hidrópica no fígado (Figura 21), além da congestão nos rins.
O fígado é o principal órgão de armazenamento de vários lipídios. Nele, os triglicerídeos, principalmente, podem acumular-se como gotículas de gordura, originando a esteatose hepática (SPOREA et al, 2018). Essa condição é caracterizada pela visualização microscópica de áreas citoplasmáticas negativas à coloração por HE. Estas áreas se apresentam como pequenas vesículas citoplasmáticas de número e tamanho variável. Está associada à diversas doenças hepáticas ou à alguma situação que prejudique ou iniba moléculas receptoras que
controlam as enzimas responsáveis pela oxidação e síntese de ácidos graxos. Porém, se a causa for removida e não houver outras complicações, a esteatose tem um bom prognóstico e pode ser reversível (LIU et al, 2018; MEDINA et al., 2004; SPOREA et al., 2018). Como visto neste trabalho, os animais apresentaram apenas outras manifestações de proteção ao órgão, como hematopoise extramedular (células da medula atuando em possível lesão) e apoptose. Todos esses achados são comuns na espécie estudada, visto que diversos marcadores genéticos atuam no desenvolvimento deles (ROMEO et al., 2008). Portanto, nenhuma dessas alterações pode ser atribuída ao tratamento com PA-Int6.
Outra alteração reversível não-letal encontrada no tecido hepático dos animais avaliados neste estudo foi a degeneração hidrópica, também chamada de edema celular ou degeneração vacuolar. É caracterizada pelo acúmulo citoplasmático de água e eletrólitos devido a incapacidade da célula de manter o equilíbrio iônico e a homeostasia de fluidos. Na microscopia, as células ficam alargadas (alteração da proporção citoplasma/núcleo), com citoplasma claro, núcleo em posição centralizada e tamanho variados de vacúolos com contornos imprecisos, dando aspecto de citoplasma rendilhado (ABDELHALIM, JARRAR, 2011; LAW; BRUNT, 2010; ROBBINS; COTRAN, 2016).
A hematopoiese extramedular é caracterizada pela formação e desenvolvimento de células sanguíneas em outro local que não seja a medula óssea. É uma condição comum em animais jovens, porém em adultos pode estar relacionada a alguma variação fisiológica, que nesse estudo é possível associar a uma sobrecarga de metabolização do PA-Int6 pelo fígado (SOHAWON et al., 2012; YAMAMOTO et al., 2016).
A apoptose é um mecanismo de morte programada acionada como estratégia de proteção para eliminar hepatócitos danificados. O fígado está constantemente exposto a condições de estresse, visto que desempenha papel fundamental na homeostase metabólica através das suas várias funções: síntese, armazenamento, redistribuição e desintoxicação. Para tanto, a apoptose acionada, por via hipotalâmica, atua para eliminar alguma lesão no tecido (MIYAMURA et al., 2017). Neste estudo, provavelmente o composto causou alguma lesão pontual no fígado e o mecanismo de apoptose foi acionado para eliminá-la e recuperar o órgão, sugerindo uma lesão reversível (MIYAMURA et al., 2017; YU et al, 2019).
Estudos já demonstraram citotoxicidade para alguns derivados de tiossemicarbazonas (FERRAZ et al., 2009, PAPE et al., 2016), sugerindo que a introdução de um substituinte fenil na posição N4 dessas moléculas pode contribuir para aumentar a toxicidade delas (BERNHARDT et al., 2009; HALL et al., 2009; SOARES et al., 2012). Entretanto, os resultados obtidos com o PA-Int6 neste trabalho foram bastante satisfatórios do ponto de vista da segurança, uma vez que não foram observados sinais clínicos de toxicidade durante as avaliações aguda e subcrônica deste derivado de isatina-tiossemicarbazona.