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4.4.1 Cromatografia líquida de ultra eficiência – CLUE

O cromatógrafo utilizado foi o UFLC XR (Shimadzu) equipado com degaseificador DGU-20A3, sistema de bombas binário LC-20AD XR, auto amostrador SIL-20AC XR, forno da coluna CTO-20AC, sistema de detecção DAD SPD-M20A e módulo de comunicação com o computador CBM-20A. Foram utilizadas colunas Shim-pack com grupos octadecilsilano (C18), modelo XR-ODS: 50 mm x 3 mm e 75 mm x 4.6 mm. O diâmetro interno de partícula foi 2,2 µm. Antes de introduzidos no sistema os solventes, em ambos os métodos, foram filtrados em membrana de 0,22 μm (Millipore) e desgaseificados por ultrassom (QUIMIS-Q3350).

4.4.1.1 Preparo de amostras

Para preparar a solução estoque foi pesado 10 mg de monocrotalina em um balão volumétrico de 10mL, e completou-se o balão com água:metanol (50:50), obtendo-se assim uma solução estoque de 1000ppm (1 mg.mL-1), essa solução foi armazenada na temperatura de 4°C e envolvida com papel alumínio para proteção da luz.

A partir dessa solução é preparada a solução padrão, em que pega 300 µL da solução estoque e coloca em um microtubo de 1,5 mL, se obtendo então uma concentração de 100 ppm (0,1 mg.mL-1), sendo assim foram preparados 4 microtubos, pois foram realizadas 4 análises diferentes, cada uma com uma fase móvel diferente. Nesses microtubos, para ser obter a concentração de 100ppm, foram adicionados 1200 µL de suas fases móveis utilizadas na proporção de 50%. A amostra que foi analisada com a fase móvel de água:metanol, foi completado o microtubo com àgua:metanol (50:50), a que foi analisada com a fase móvel água:acetonitrila, se adicionaou no microtubo água:acetonitrila (50:50), a que foi analisada com ácido fórmico 0,1%:metanol, foi colocado no microtubo ácido fórmico 0,1%:metanol (50:50) e para a fase móvel de ácido fórmico 0,1 %: acetonitrila, foi completado o microtubo com ácido fórmico 0,1 %: acetonitrila (50:50).

Foram realizados quatro métodos com o CLUE: Método 1 composta por água e metanol (MeOH); método 2 composta por ácido fórmico (AF) 0,1% e MeOH; método 3 constituída por água e acetonitrila (ACN) e método 4 formada por AF 0,1% e ACN. Esses métodos foram realizados de acordo com as condições da Tabela 1.

Tabela 1 – Condições cromatográficas utilizadas na análise do CLUE.

Parâmetros Condições

Composição de Fase Móvel Água:MeoH/ AF 0,1 %: MeOH / Água:ACN / AF 0,1 %:ACN Fase estacionária C18: 50x3 mm e 75x4,6 mm, partículas 2,2µm

Concentração 200 ppm (0,2 mg.mL-1) Gradiente (%) 5 – 100 solvente orgânico Fluxo (mL.min-1) 0,2

Volume de injeção (µL) 1 Temperatura (°C) 30

Tempo (min) 45

O gradiente utilizado no CLUE está esquematizado na Tabela 2

Tabela 2 - Esquema da análise em gradiente da monocrotalina por CLUE

4.4.2 Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas – CL/EM

O equipamento utilizado foi o CL-EM/TOF (Agilent) constituído pelos seguintes módulos: Sistema de Cromatografia Líquida 1260 Infinity® (Bomba quaternária, autoinjetor, forno para coluna, equipado com bomba, pré- aquecimento de fase móvel e termostatizador de amostras) acoplado a sistema de espectrometria de massas do tipo TOF, modelo 6230BA, de alta resolução (22.000 FWHM) e exatidão de massa, erros <1 ppm com fonte Electrospray, as quais cobrem todo o espectro de compostos químicos, de polares a apolares e em diferentes matrizes e gerador de nitrogênio de capacidade para vazão de 32L.min-1. Foi utilizada coluna Shim-pack com grupos octadecilsilano (C18), modelo XR-ODS de 50 mm x 3 mm com partícula de 2,2 µm.

Time (min) Solvente A (água/ácido fórmico 0,1%) Solvente B (metanol/acetonitrila) 1 0 – 5 95 5 2 5 – 35 0 100 3 35 – 40 0 100 3 40 – 41 95 5 4 41 – 45 95 5

4.4.2.1 Preparo de amostras

A solução estoque utilizada foi a mesma que a utilizada no CLUE.

Para o preparo da solução padrão foi retirado da solução estoque 3 µL e colocado em um microtubo de 1,5 mL, atingindo uma concentrado de 2 ppm (0,002 mg.mL-1), foram preparados dois diferente microtubos e eles foram completados de acordo com a fase móvel utilizada.

Os que utilizaram água:acetronitrila foram utilizados para diluição água:acetonitrila (50:50), e os que utilizaram ácido fórmico 0,1%:acetonitrila, para completar o microtubo foi utilizado ácido fórmico 0,1 %: acetonitrila (50:50).

Sendo assim foram realizados mais dois métodos com o CL/EM, que foram os seguintes: Método 5 composta por água e ACN; método 6 constituída por AF 0,1% e ACN. Esses métodos foram analisados de acordo com as condições da Tabela 3.

Tabela 3 – Condições cromatográficas utilizadas na análise no CL/EM

PARÂMETROS CONDIÇÕES

Composição de Fase Móvel Água:ACN / AF 0,1 %: ACN Fase estacionária C18: 50x3 mm, partículas 2,2µm

Concentração 2 ppm (0,002 mg.mL-1) Fluxo (mL.min-1) 0,3 Volume de injeção (µL) 3 Temperatura (°C) 25 Tempo (min) 30 Massa 326

Tabela 4 - Esquema da análise em gradiente da monocrotalina por CL/EM Time (min) Solvente A (água/ácido fórmico 0,1%) Solvente B (metanol/acetonitrila) 1 0 – 3 95 5 2 3 – 20 0 100 3 20 – 25 0 100 4 25 – 26 95 5 5 26 – 30 95 5

Em seguida para uma otimização do método foi realizado o método 7, para esse método a amostra padrão e a amostra estoque foi diluída apenas com ácido fórmico 0,1%, ficando com uma concentração final de 2 ppm (0,002 mg.mL-1), com a mesma concentração da amostras do método 5 e método 6. A fase móvel do método 7 foi composto por AF 0,1% e ACN, nas condições da Tabela 5 e com o gradiente esquematizado na Tabela 6.

Tabela 5 – Condição cromatográfica utilizada na análise no CL/EM, após otimização

PARÂMETROS CONDIÇÕES

Composição de Fase Móvel AF 0,1 %: ACN

Fase estacionária C18: 50x3 mm, partículas 2,2µm Concentração 2 ppm (0,002mg.mL-1) Fluxo (mL.min-1) 0,2 Volume de injeção (µL) 1 Temperatura (°C) 25 Tempo (min) 25 Massa 326

Tabela 6 - Esquema da análise em gradiente da monocrotalina por CL/EM, após otimização Time (min) Solvente A (água/ácido fórmico 0,1%) Solvente B (metanol/acetonitrila) 1 0 – 3 95 5 2 3 – 20 0 100 3 20 – 25 0 100

4.4.2.2 Preparo de fase móvel

Para se analisar a monocrotalina foram utilizadas quatro soluções que foram as seguintes: A água ultrapura, obtida a partir do equipamento de milli- q®; o metanol (MeOH), a acetonitrila (ACN); e Ácido Fórmico 0,1 %.

Todos os solventes utilizados foram grau HPLC, todos eles foram filtrados, inclusive a amostra, em filtro de diâmetro de 0,22 µm para o CLUE, no CL/EM, não é necessário filtrar os solventes, apenas a amostra.

Para o preparo do ácido fórmico 0,1 %, utilizou-se 0,5mL e 499,5 mL de água ultrapura, obtendo então 500 mL dessa solução.

4.4.2.3 Preparo da curva analítica

Para ser realizado a curva analítica foram preparados 6 concentrações diferentes de monocrotalina. A primeira concentração foi de 2 ppm (0,002 mg.mL-1), para ela retirou-se 4 µL da solução estoque, colocado em um microtubo de 2,0 mL e acrescentado 1996 µL de ácido fórmico 0,1%. A segunda concentração foi de 1 ppm (0,001 mg.mL-1), retirou-se 1250 µL da solução de 2 ppm colocou em um microtubo de 1,5 mL e acrescentou 1250 µL de ácido fórmico 0,1 %. Para a terceira concentração foi retirado 625 µL da concentração de 2 ppm para um microtubo de 1,5 mL e adicionou-se 875 µL de ácido fórmico 0,1 %, obtida então a concentração de 0,5 ppm (0,0005 mg.mL-1) no terceiro ponto. A quarta concentração de 0, 25 ppm (0,00025 mg.mL-1) foi

obtida pegando-se 625 µL da concentração de 1 ppm transferindo para um microtubo de 1,5 mL e adicionou 875 µL de ácido fórmico 0,1 %. Na quinta concentração, de 0,1 ppm (0,0001 mg.mL-1), foi retirado 75 µL da solução de 2 ppm e adicionado em um microtubo de 1,5 mL e completado com 1425 µL com ácido fórmico 0,1 %. A sexta concentração é de 0,05 ppm (0,00005 mg.mL-1), para ser preparada utilizado 625 µL da solução de 0,25 ppm e colocada em um microtubo de 1,5 mL e acrescentado 875 µL de ácido fórmico 0,1 %.

4.4.2.4 Preparo do extrato

Para o preparo do extrato, foi utilizado 1 grama de semente de Crotalaria

retusa, essas sementes foram trituradas com grau e pistilo em seguida são

colocados em um recipiente para o armazenamento e acrescentado 10 mL de metanol ficando em maceração por 24 horas, envolvido com papel alumínio e em temperatura ambiente (NEGREIROS NETO, 2016).

Esse extrato ficou em uma concentração de 100000 ppm (100 mg.mL-1). Esse extrato foi diluído para 200 ppm (0,2 mg.mL-1), para isso foi retirado 3 µL do extrato, adicionado em um microtubo de 1,5 mL e acrescentado 1497 µL de ácido fórmico 0,1 %.

5 RESULTADOS

5.1 TG/DTG, DSC e DTA da Monocrotalina

Foram analisados TG e DSC para a monocrotalina nas razões de aquecimento (β) 2,5; 5; 10, 20 e 40 ° C.min-1

e suas respectivas curvas foram obtidas, como pode ser visto na Figura 2 e na Figura 5. Na Tabela 7, estão descritos todos os eventos que foram observados nas curvas TG nas diferentes razões de aquecimento.

Figura 2 – Curvas TG da monocrotalina, nas razões de aquecimento de 2,5 °C.min-1 (vermelho); 5 °C.min-1 (azul); 10 °C.min-1 (verde); 20 °C.min-1 (roxo) e 40 °C.min-1 (cinza).

Fonte: Própria do autor.

Na Tabela 7 pode ser observado, que é no terceiro evento que ocorre a maior termodecomposição da monocrotalina, ou seja, é quando ocorre a maior perda de massa (Δm), observa-se também que quanto maior a razão de aquecimento (β), maior a temperatura para que o evento ocorra.

Ao avaliar a razão de aquecimento de 10°C.min-1 da curva TG, Figura 3, é visto que a primeira etapa ocorre entre as tempeturas de 32 e 100 °C, tendo uma perda de massa de 0,7%, ou seja, uma pequena perda que ocorre provavelmente devido uma dessolvatação, água ou algum solvente retido na amostra de monocrotalina durante o processo de isolamento, enquanto que nas outras etapas tem-se respectivamente perdas de massa de 4,2; 64,7; 21,3 e 3,2 %.

Figura 3 – Curvas de TG/DTG na razão de aquecimento de 10 °C.min-1

Fonte: Própria do autor

A provável reação que ocorre durantes esses eventos que foram observados nas curvas TG pode ser observada na Figura 4, nela se observa até o terceiro evento que é quando ocorre a maior termodecomposição e após esse terceiro evento na análise de TG resta apenas a base nécica na substância inicial, os outros dois eventos de termodecomposição é quando ocorre a degradação desse anel da base nécica.

Figura 4 – Provavel reação de degradação da monocrotalina com o aquecimento.

Fonte: Autor próprio

Tabela 7 – Relação dos eventos térmicos observados nas curvas TG

β (°C.min-1 ) 1° 2° 3° 4° 5° Residuo 2,5 T (°C) 26 – 100 3 100 - 185 4,7 185 - 321 66,8 321 - 443 17,1 443 - 900 3,8 Δm(%) _{8,2 %} 5,0 T (°C) _{25 – 100} 0,6 119 - 199 6,0 200 - 280 61,5 281 - 469 19,3 469 - 900 Δm(%) 2,9 9,7 % 10,0 T (°C) 32 – 100 0,7 123 - 204 4,2 203 - 286 64,7 287 - 517 21,3 517 - 900 3,2 Δm(%) _{5,9 %} 20,0 T (°C) 32 - 100 0,5 124 - 208 2,8 208 - 313 66,1 212 - 595 21,5 595 - 900 3,7 Δm(%) _{5,4 %} 40,0 T (°C) _{33 - 100} 0,5 143 - 234 4,8 212 - 342 66,5 341 - 576 19,4 576 - 900 12,5 Δm(%) _100%

Ao analisar as curvas DSC, Figura 5, também é observado que ocorrem cinco eventos, entretanto o primeiro evento não pode ser observado na razão de aquecimento (β) de 2,5 °C.min-1

, nesse evento, ocorre a contração da amostra de monocrotalina, por isso ele é observado nas curvas DSC, essa contração pode ser comprovada quando se observa os resultados da captura de imagens do processo de decomposição, pois nessa temperatura é observado essa contração da amostra. Nesse primeiro evento, ainda pode ser observado que quanto maior a razão de aquecimento melhor de observar esse evento.

Figura 5 – Curvas DSC da monocrotalina, nas razões de aquecimento de 2,5 °C.min-1 (vermelho); 5 °C.min-1 (azul); 10 °C.min-1 (verde); 20 °C.min-1 (roxo) e 40 °C.min-1 (cinza).

Fonte: Própria do autor

Com as curvas DSC pode ser observado no segundo e terceiro evento uma fusão seguida de decomposição, o que pode ser observado quando sobrepõe a curva TG com as DSC na razão de aquecimento de 10 °C.min-1. Analisando a razão de aquecimento de 10 °C.min-1, o primeiro evento apresenta uma Tonset em 133 °C e Tpico em 143 °C, com entalpia (ΔH) de 3,91

J.g-1, sendo esse evento exotérmico, quando comparado com a captura de imagem do processo de decomposição, é observado que esse evento ocorre devido uma contração da monocrotalina, Figura 10 (imagem 4). O segundo evento, na β 10 °C.min-1

, apresenta uma Tonset em 202 °C e Tpico em 204 °C,

com uma entalpia de 28 J.g-1, sendo esse evento endotétmico, é nele que ocorre a fusão. O terceiro evento é seguido do segundo, este é um evento exotérmico que ocorre com uma Tonset em 205 °C e uma Tpico em 208 °C, tendo

uma ΔH 138,83 J.g-1

, ao ser analisado as sobreposições das curvas TG e DSC na β 10 °C.min-1 Figura 7, é observado também que é nesse evento que

acontece a maior decomposição da substância. O quarto é um evento endotérmico ele expõe uma Tonset em 218 °C e o Tpico em 231 °C, tendo um e

ΔH de 66,29 J.g-1

, nesse evento também ocorre termodecomposição da monocrotalina, que pode se observado na Figura 7 que sobrepõe DSC e TG. No quinto e último evento, ele ocorre com uma Tonset em 394 °C e uma Tpico em

404 °C, a ΔH de 109 J.g-1

. Observa-se que esse evento é exotérmico e nele quando analisando a sobreposição das curvas TG e DSC, Figura 7, observa-se que ocorre uma pequena termodecomposição também.

Figura 6 – Curvas DTA e DSC na razão de aquecimento de 10 °C.min-1

Fonte: Própria do autor

Todos esses eventos estão descritos nas Tabelas 7 (eventos de TG) e Tabela 8 (eventos de DSC).

Tabela 8 – Relação dos eventos térmicos observados nas curvas DSC. Eventos Razões de aquecimento (°C.min-1) TOnset (°C) TEndset (°C) Tpico (°C) Energia (J.g-1) 2,5 --- --- --- --- 5 110 143 144 6,0 (exo) 1º 10 133 149 143 3,9 (exo) 20 118 157 132 9,3 (exo) 40 123 163 149 8,6 (exo) 2,5 194 196 196 21,5 (endo) 5 198 201 200 46,4 (endo) 2º 10 202 205 204 28,0 (endo) 20 205 211 209 41,0 (endo) 40 207 209 211 94,9 (endo) 2,5 196 199 197 91,5 (exo) 5 201 204 206 89,1 (exo) 3º 10 205 212 208 138,8 (exo) 20 211 222 216 117,4 (exo) 40 216 236 223 129,5 (exo) 2,5 203 209 209 50,7 (endo) 5 213 228 215 66,3 (endo) 4º 10 218 244 231 66,3 (endo) 20 226 262 240 136,5(endo) 40 238 277 253 104,1(endo) 2,5 372 389 381 101,5 (exo) 5 387 412 392 51,6 (exo) 5º 10 393 430 404 109,0 (exo) 20 406 474 425 165,3 (exo) 40 394 468 425 39,4 (exo)

Os eventos podem ser melhor analisandos quando se sobrepõe as curvas TG e DSC na razão de 10 °C.min-1, e desta forma observa-se tanto as perda de massa quando as transformações físicas, esta sobreposição pode ser

endo

visualizadas na Figura 7, além das curvas TG e DSC, estão sobreposta também para auxiliar na análise dos resultados as curvas DTA e Derivada de TG (DTG).

Figura 7 – Curvas TG/DTG, DTA e DSC para monocrotalina na razão de aquecimento de 10 °C.min-1.

Fonte: Própria do autor.

Essas técnicas térmicas são muito utilizadas para se avaliar os comportamentos das substancias, como pode ser visualizado no estudo de PINTO, B. V.; FERREIRA, A. P. G. e CAVALHEIRO, E. T. G.,2017, que foi analisado a decomposição termica da fluoxetina utizado para isso as técnicas de TG/DTG-DTA, DSC e TG-FTIR. E o estudo de GALO, et al.,2016.

Figura 8 – Destaque do primeiro evento das curvas DSC em maior aumento, para melhor visualização, quando ocorre a contração da monocrotalina, nas razões de aquecimento de 2,5; 5; 10; 20 e 40 °C.min-1

Fonte: Própria do autor.